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探析生物介质中MN9202检测方法的建立及其应用
 建立生物介质中1,4二氢2,6二甲基4(3硝基苯基)3,5吡啶二甲酸甲戊酯(MN9202)的高效液相色谱检测方法. 方法:分别以细胞和大鼠血浆作为生物样本,用乙醚对含药Caco2细胞裂解液及血浆样品进行预处理,用反相高效液相色谱法分析生物样本中的原形药物的浓度. 结果:在选定的色谱条件下,MN9202和干扰物质能够实现较好的分离,测定细胞样品的工作曲线回归方程为Y=0.0048X+0.0592,r=0.9997,n=7 (P<0.01),线性范围为20~500 mg/L. 测定血浆样品的工作曲线回归方程为Y=0.0058X+0.1468,r=0.9998,n=7(P<0.01),线性范围为20~500 mg/L. 结论:所建立的分析方法简便、稳定、灵敏、准确,可用于生物介质中MN9202的浓度检测.
  【关键词】 MN9202;反相高效液相色谱;生物介质
  0引言
  1,4二氢2,6二甲基4(3硝基苯基)3,5吡啶二甲酸甲戊酯(MN9202)是一种二氢吡啶类钙离子阻滞剂,也是目前研究报道的具有较好的药理效应的二氢吡啶类药物之一. MN9202具有明显的扩血管效应,其作用与其抑制电压依赖性钙通道,减少Ca2+内流有关. MN9202也具有对抗血小板聚集诱导剂角叉菜胶引起血栓的作用,作用机制可能与共抑制红细胞,血小板聚集,保护血管内皮,舒张痉挛血管有关[1]. 二氢吡啶类药物口服剂量小、有效血药浓度低,目前国内外所用的检测方法包括LC,LCMS等,为了有效检测其血药浓度及便于进行相关的研究,必须建立灵敏度较高的检测方法. 我们通过优化色谱条件,选择具有强吸收的237 nm处作为二氢吡啶类药物的检测波长,从而提高了灵敏度,可用于生物介质中MN9202的浓度检测.
  1材料和方法
  1.1材料选用大鼠血浆作为生物介质之一[2],大鼠[(200±15) g]由第四军医大学实验动物中心提供. 实验中选用的另外一种生物介质是Caco2细胞,它来源于人结肠癌细胞,在体外培养条件下,能够分化形成单层的细胞的膜,与小肠上皮细胞结构和生理状况相似,是目前国内外公认的体外药代动力学研究的理想模型[3]. Caco2细胞接种于24孔板(Costar,美国),培养10~14 d,用于实验[4]. 高效液相色谱仪(美国Beckman公司),高速离心机(日本Hitachi CR21F),色谱分析柱为C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm, phenomenex). MN9202和 MN9203(内标)为本教研室合成,纯度大于98%,乙腈(色谱纯,TEDIA公司),甲醇(色谱纯,TEDIA公司),碱化液50 mmol/L的磷酸氢二钠(用NaOH调节pH到12),其他试剂均为分析纯.
  1.2方法
  1.2.1色谱条件色谱分析柱为C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,phenomenex),流动相:乙腈/水(82/18,V/V),流速:1 mL/min,检测波长为237 nm.
  1.2.2生物样品预处理①细胞给药后反复冻融成为细胞裂解液;取0.5 m L细胞裂解液(其中药物的浓度为500 mg/L),加入0.1 mL的 MN9203(内标,终浓度为200 mg/L),再加入1 mL的碱化液,用1 mL的乙醚提取两次,收集提取液于尖底试管中,于通风橱中由空气流自然挥干. 残留物用50 μL的甲醇溶解后进行高效液相分析. ②大鼠腹腔静脉取血,肝素抗凝,离心得血浆[5]. 取0.5 mL血浆,加入0.5 mL含有内标的药物(药物浓度和内标的浓度分别为500 mg/L和200 mg/L),混匀,其余步骤同①.
  1.2.3分析方法培育10~14 d的Caco2细胞,呈单层细胞膜的形式,可以用于药物的摄取实验. 将MN9202配制成一定的浓度,在每孔细胞上加入相同体积的药物,并将药物与细胞一起孵育5,10,20,30,40,60 min,弃去培养液,用PBS冲洗细胞3次,细胞反复冻融成为细胞裂解液,用1.2.2中的方法分析细胞裂解液中药物的浓度,观察Caco2细胞对药物的摄取情况.
2结果
  2.1提取溶剂的选择选用乙醚作为提取溶剂,对细胞和血浆等生物样本中药物,具有提取率高,挥发速度快,杂质干扰较少的优点[4].
  2.2流动相和检测波长选用药物具有强吸收的237 nm作为检测波长,将曾用的甲醇和水优化设计成乙腈和水(82/18,V/V)为流动相. 干扰物质,内标以及药物能够实现基线分离,见色谱图.
  2.3工作曲线回归方程、线性范围以MN9202与内标(MN9203)的峰面积比为纵坐标,以MN9202的浓度为横坐标制作工作曲线. 应用Excel软件采用最小二乘法得到细胞样品的工作曲线回归方程:Y=0.0048X+0.0592,r=0.9997,n=7(P<0.01),线性范围为20~500 mg/L;测定血浆样品的工作曲线回归方程(方法同上):Y=0.0058X+0.1468,r=0.9998,n=7(P<0.01), 线性范围为20~500 mg/L.
  2.4回收率和精密度当细胞中的MN9202的浓度为20,100,500 mg/L的时候,方法回收率分别为(94.75±7.03)%,(100.35±2.97)%和(107.20±5.01)%. 其日间精密度RSD为11.28%,6.25%,9.23%;日内精密度RSD为14.09%,4.62%,3.22%(P<0.01). 当血浆中的MN9202的浓度为20,100,500 mg/L的时,方法的回收率为(88.75±9.82)%,(98.09±8.58)%,(98.26±6.22)%,其日间精密度RSD为13.65%,5.88%,3.89%(P<0.01);日内精密度RSD为11.40%,4.64%,3.89%(P<0.01,图1).

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