简介：摘要冠状病毒是有包膜的、单股正链RNA病毒，基因组长约26~32 kb。人类冠状病毒感染通常引起上呼吸道与下呼吸道疾病，严重程度从普通感冒到严重急性呼吸综合征不等。SARS-CoV-2是2019年开始在全球范围内暴发流行的冠状病毒，通过反向遗传技术对人冠状病毒cDNA进行操作，构建感染性克隆，有助于对冠状病毒基因组分与功能进行深入研究，并应用于疫苗与药物研发。因此当前SARS-CoV-2反向遗传学技术的建立与应用研究尤为重要。本文讨论了人冠状病毒反向遗传技术及应用，对SARS-CoV-2感染性克隆构建技术与应用进展进行了综述。

简介：摘要目的利用规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)-CRISPR相关蛋白9(CRISPR associated protein 9，Cas9)技术对痘苗病毒(vaccinia virus, VACV)胸腺激酶(thymidine kinase，TK)区进行定向重组，建立高效的痘苗病毒靶基因插入重组技术。方法设计合成靶向TK区的引导RNA(guide RNA, gRNA)对应的2条互补寡核苷酸，磷酸化修饰后变性退火，克隆到去除核定位信号的PX458载体上，同时改造原有TK区重组质粒。将gRNA及Cas9共表达质粒转染293T细胞，介导VACV与TK区重组质粒进行同源重组，然后通过蓝白斑的出现率评估病毒重组率。结果本研究中设计并合成的gRNA序列介导的重组效率大于1%，高于经典的同源重组方法10倍以上。结论本研究利用CRISPR/Cas9技术建立了高效痘苗病毒TK区重组体系，为新发突发传染病的疫苗或多价研究以及肿瘤治疗等提供临床前研究技术支持。

简介：摘要目的通过世界卫生组织(world health organization，WHO)新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)抗体国际标准品(international standard，IS)(G样本)、抗体参考盘(样本E、F、H、I、J)的应用降低SARS-CoV-2抗体检测结果差异、提高检测结果一致性。方法利用基于SARS-CoV-2活病毒的微量中和试验、假病毒中和试验以及商品化的ELISA试剂盒对WHO的SARS-CoV-2抗体IS和参考盘等共10个样本(A~J)分别进行检测，对检测结果进行分析比较。结果以IS为参考品确定其他样本的相对浓度，降低了检测结果之间的差异。假病毒中和试验、ELISA检测血清抗体参考盘结果与基于SARS-CoV-2 HB02株的中和试验基本一致，个别试剂可检测弱阳性样本。结论SARS-CoV-2抗体IS的使用促进了血清学检测方法的标准化，抗体参考盘适用于基于SARS-CoV-2原型株的所有检测方法，假病毒中和试验、ELISA等在一定程度上可作为活病毒中和试验的替代方法。

简介：摘要目的基于脂质多聚复合物(lipopolyplex, LPP)递送平台和保守抗原开发的新型流感病毒mRNA疫苗在小鼠体内的免疫原性评价。方法将4个拷贝的甲型流感病毒基质蛋白2胞外域(extracellular domain of matrix 2 protein，M2e)与核蛋白(nucleoprotein，NP)编码基因按照真核密码子优化，串联构建融合抗原并体外转录为4M2eNP-mRNA，利用LPP技术平台制备甲型流感病毒mRNA疫苗(LPP-4M2eNP)。转染真核细胞后通过免疫荧光体外验证NP和M2e表达；BALB/c小鼠经肌肉注射10 μg、30 μg mRNA疫苗，间隔4周加强免疫一次，酶联免疫法检测免疫后血清抗体滴度，免疫斑点法检测细胞免疫应答。结果间接免疫荧光检测表明4M2eNP-mRNA转染真核细胞后NP和M2e正确表达。单针免疫可明显诱导抗原(NP和M2e)特异性细胞免疫应答，加强免疫后在小鼠中诱发了抗原特异性体液免疫应答呈Th1型偏向；NP细胞免疫应答显著提高，但M2e细胞免疫应答强度无明显改变。结论本研究制备的LPP-4M2eNP疫苗在小鼠中单针免疫即可诱导较强的细胞免疫应答，加强免疫后可诱导明显的体液和细胞免疫应答，表明该疫苗具有较好的研发和应用前景。