简介:目的:建立检测猪常见致病菌的反向斑点杂交方法。方法:将23SrRNA基因芯片用的针对12种细菌的25~30mer探针加长到30~38mer,2对通用引物序列不变。用地高辛标记下游引物,以尼龙膜为载体制备膜芯片,检验探针/膜杂交的特异性和敏感性;另外设计1条大肠杆菌K88基因探针、一段带K88探针的报告基因和1对报告基因的反向PCR引物,在PCR体系中增加封口的K88报告基因和反向引物对,被检样品扩增后进行膜杂交。结果:修改的13条探针与参考目标菌株在膜上成特异性杂交,对52个参考菌株和野外分离株的检测准确率为92%;膜杂交的敏感性与玻片芯片接近,最小检出量为100fgDNA;在尼龙膜上增加K88探针,与3重PCR产物杂交,可以检测到大肠杆菌K88毒力基因。结论:建立的反向斑点杂交方法简便快速,检测成本低,可用于仪器设备不足的实验室,同时可以加入检测如大肠杆菌K88等致病基因,提高基于保守基因的芯片的诊断能力。
简介:目的:利用基因芯片技术,以细菌16SrDNA和23SrDNA为靶序列筛选引物和探针,建立快速、准确的检测水产食品中肠道致病菌的方法。方法:将致病菌的16SrDNA和23SrDNA全序列进行软件比对,在可变区和恒定区分别设计特异性寡核苷酸探针和通用性引物,点样于玻片制成基因芯片。致病菌DNA经过通用引物扩增后与芯片上的探针杂交,然后通过扫描图像对结果进行判断。对基因芯片检测的灵敏度进行了评价,并对模拟污染样本进行了实际检测,以验证所建立的方法。结果:设计的4对通用引物在同一条件下能够扩增7种常见肠道致病菌。在均一的杂交条件下能够同时检测单核细胞增生利斯特菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、弗氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和肠出血性大肠杆菌O157∶H7;以鼠伤寒沙门氏菌为对象,本方法的检测灵敏度可达到10^-3cfu/mL,实际检测模拟污染的样本的正确率达到100%。结论:建立的基因芯片系统可以准确而稳定地实现对7种水产食品中常见致病菌的通用检测,为食源性感染的诊治与预防提供了有效的技术手段和方法依据。