简介:目的建立缺血性心肌纤维化小鼠模型并探讨其胶原沉积机制。方法将BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,每组10只。实验组予以腹部皮下注射异丙肾上腺素50mg/kg,每天2次,连续10d。对照组同法注射生理盐水。对比体表心电图,45d后处死小鼠,天狼猩红染色观察心脏Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维含量,荧光定量PCR检测心脏基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)基因表达,免疫组化染色分析心、肝、肾组织层粘连蛋白(LN)的表达。结果实验组小鼠室性心律失常增多,心率加快(P〈0.05);心脏胶原沉积较多,MMP-9、TIMP-1、LN表达上调(P〈0.05),肝、肾组织LN无明显改变(P〉0.05)。结论异丙肾上腺素能制备缺血性心肌纤维化小鼠模型,其机制与MMP-TIMP失衡有关。
简介:摘要目的探讨运用CRISPR/Cas9基因编辑技术高效构建热休克因子1(heat shock factor 1,HSF1)基因敲除的小鼠模型,为小鼠原发骨肉瘤模型建立前期基础。方法根据Hsf1基因结构的第9外显子选择相应的gRNA(guide RNA)并进行筛选,通过PCR扩增出sgRNA(small guide RNA)转录模版,得到4个上游引物。随后将sgRNA进行体外转录并通过TubeScreen平台筛选,筛选切割有效的sgRNA,从筛选结果中选取切割效率最高的sgRNA用于后续实验。运用PCR扩增出转录spCas9mRNA的模板,接着体外转录Cas9mRNA。将体外转录得到的sgRNA与Cas9mRNA一起注射入健康的C57BL/6小鼠受精卵内,剪取出生小鼠尾巴提取组织并进行PCR测序鉴定。选取F0代杂合子母鼠与野生型公鼠交配得到F1代子鼠,结合琼脂凝胶电泳和基因测序检测F1代鼠基因碱基的突变情况。选取F1代杂合子公鼠与F0代母鼠回交得到F2代子鼠,剪取鼠尾组织并测序,最终得到F2代纯合子敲基因小鼠。运用PCR观察sgRNA切割效率与鼠尾组织的测序,通过观察凝胶电泳结果来判断小鼠是否为杂合,同时利用snapgene软件进行基因序列比对判断碱基片段缺失。结果经PCR扩增得到上游引物sgRNA-1primer-F、sgRNA-2primer-F、sgRNA-3primer-F、sgRNA-4primer-F与下游引物sgRNAprimer-R。经过sgRNA的体外转录和筛选,sgRNA-1, sgRNA-2和sgRNA-4切割效率高,被选取用于后续实验。将T7promoter添加到Cas9mRNA的5’端,运用PCR和体外转录试剂盒得到Cas9mRNA。把混合的Cas9-sgRNA溶液注入到小鼠受精卵中并进行培养。把培养至二细胞的受精卵注射到假孕母鼠的壶腹部,并成功获得F0代小鼠。通过琼脂凝胶电泳结果判断共得到F0代杂合子小鼠8只。将F0代3号杂合子母鼠与健康的野生型公鼠繁育后,结合PCR与测序比对,共得到F1代杂合子基因敲除小鼠3只。将三只F1代杂合子公鼠与F0代3号母鼠回交,得到F2代小鼠。通过对F2代小鼠电泳和测序比对的结果观察,证实7只小鼠缺失Hsf1碱基序列,电泳结果为突变型条带且不存在野生型条带,鉴定为纯合子;得到的F2代纯合子小鼠能够稳定繁育,结果证明本实验成功建立Hsf1基因敲除小鼠模型。结论成功运用CRISPR/Cas9技术构建Hsf1基因敲除小鼠模型,稳定性强,可重复性高,为进一步研究Hsf1基因表达产物及原发骨肉瘤小鼠模型的建立奠定了基础。
简介:目的利用聚己内酯(PCL)生物可降解高分子材料与普朗尼克F68(PluronicF68,F68)共混物作为载体材料与抗癌药物紫杉醇(paclitaxel,PTX)组成微球控释系统,并对其在小鼠体内的抗肿瘤活性进行研究。方法采用乳化-溶剂挥发法制备紫杉醇微球,研究PCL/F68载药微球及PCL载药微球的体外释放并用扫描电子显微镜比较微球表面形态,考察PCL/F68载药微球对小鼠肝癌H22实体瘤和腹水瘤的抗肿瘤活性并与紫杉醇注射液进行比较。结果紫杉醇的包封率约为90%。扫描电镜结果显示微球球形圆整,PCL微球表面光滑,而PCL/F68微球表面粗糙,呈现多孔状(Fig1)。体外释放实验表明紫杉醇微球有明显的缓释性能。
简介:背景:骨髓间充质干细胞具有广泛的应用前途,其三系分化的能力和免疫诱导特性使其具有再生医学的应用前景。目的:从小鼠骨髓中研究分离制备Flk-1+间充质干细胞的新方法,检测了这类细胞的生物特性。方法:以小鼠骨髓为研究对象,分离单个核细胞,体外培养并扩增原始间充质干细胞,检测它们的细胞周期、表型和多系分化的能力。结果与结论:小鼠来源的骨髓来源的原始间充质干细胞呈成纤维样生长,大部分细胞处于G0/G1期,并且高表达Flk1,CD13,CD29,CD44,小鼠骨髓来源Flk-1+间充质干细胞在光镜下均呈成纤维样或多角型贴壁生长,在体外相应的诱导液环境中均可以向三系分化。提示小鼠骨髓来源Flk-1+间充质干细胞具有多向分化潜能。
简介:为研究桦褐孔菌菌质多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响,采用水提醇沉法提取粗多糖,Sevag法脱蛋白后透析,再经DEAE—SepharoseCL-6B离子交换柱进一步分离纯化,MTT法检测不同浓度的桦褐孔菌菌质多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。试验结果得到3个多糖纯化组分JZP1、JZP2、JZP3;粗多糖(JZPC)、精制多糖(JZPJ)和纯化多糖(JZP3),能够促进淋巴细胞增殖,最大增殖率分别为59.04%(1000μg/mL),44.58%(20μg/mL),39.76%(20仙g/mL)。JZP1和JZP2在1000μg/mL时抑制淋巴细胞增殖,抑制率分别15.66%和13.25%。结果表明相同浓度下粗多糖对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用强于纯化多糖,不同多糖组分表现出不同的免疫学活性,并且其免疫活性与其浓度密切相关。
简介:摘要目的制备超活化富血小板裂解液(super-activated platelet lysate,sPL),研究其对雄激素性脱发(androgenetic alopecia,AGA)小鼠模型的毛囊再生的影响,为sPL治疗AGA的临床研究提供基础。方法使用超滤离心从全血中分离富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP),用冻融方式将血小板裂解制备血小板裂解液(platelet lysate,PL)。用CaCl2结合肝素激活PRP中的血小板,冻融裂解血小板的同时用温度浮动控制方法去除纤维蛋白原,获得sPL。通过ELISA分析PRP、PL及sPL中毛囊再生相关因子含量。用丙酸睾酮注射建立C57bl/6小鼠AGA模型后,用sPL进行治疗,取小鼠背部皮肤,苏木素伊红染色判断sPL对毛囊再生的作用。结果经超滤离心及激活获得的sPL中,数种毛囊再生相关因子较PRP及PL均显著增加。AGA小鼠经sPL治疗后毛发再生明显,同时毛囊密度恢复至对照组水平(t=1.149,P=0.269 9)。结论相对于PRP与PL,sPL制备方法可获得更高的生长因子含量,且sPL对AGA小鼠具有显著的毛囊再生作用。
简介:目的:经慢病毒载体介导,制备转人α血红蛋白稳定蛋白基因(ahsp)的β654地中海贫血小鼠。方法:用巢式PCR从人血DNA中获得人ahsp基因,构建含有人ahsp基因的慢病毒载体,制备假病毒,通过卵周隙显微注射手段将其导入β654地贫小鼠的受精卵,经移植至假孕母鼠输卵管,最终孕育出转人ahsp基因的β654地贫小鼠;分析小鼠体内外源ahsp基因的表达情况及其遗传稳定性。结果:共获得了8只人ahsp阳性小鼠,转基因阳性率为32%(8/25),其中3只同时具有β654突变基因;人ahsp基因在小鼠体内的表达水平维持在小鼠自身ahsp表达量的1%左右,且可稳定遗传至子代。结论:制备了转人ahsp基因小鼠,并可遗传至子代,为在个体水平上研究α血红蛋白稳定蛋白与β地贫之间的关系提供了工具。
简介:摘要目的制备负载银粒子的改性透明质酸黏性水凝胶,探讨其在小鼠细菌定植全层皮肤缺损创面愈合中的作用及可能的机制。方法采用实验研究方法。制备多巴胺修饰的透明质酸(HA-DA)和苯硼酸修饰的透明质酸(HA-PBA),傅里叶变换红外光谱检测其特征峰。在HA-DA和HA-PBA中加入不同质量的丙烯酰胺,制备质量分数为10%、15%、20%丙烯酰胺的黏性水凝胶。观察含质量分数20%丙烯酰胺的黏性水凝胶在37 ℃下倾斜状态和倒立状态的成胶情况,旋转流变仪检测前述3种黏性水凝胶的储存模量和损耗模量。在含质量分数20%丙烯酰胺的黏性水凝胶中加入纳米银离子,制备含银黏性水凝胶,采用电感耦合等离子体质谱仪测量含银黏性水凝胶释放的银离子浓度,并计算累计银离子释放率(样本数为5)。取小鼠成纤维细胞L929,分为磷酸盐缓冲液(PBS)组、黏性水凝胶组及含银黏性水凝胶组并进行相应处理,采用细胞计数试剂盒8法检测培养1、2、3 d细胞存活情况(样本数为5)。取24只6~8周龄雄性C57BL/6小鼠,在其背部建立48个接种大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌混合悬液的全层皮肤缺损创面模型,每只小鼠2个创面。将创面分成生理盐水组、黏性水凝胶组、含银黏性水凝胶组并进行相应处理,每组16个创面,且每只小鼠的2个创面纳入不同组。伤后3、7、10、14 d,观察创面愈合情况并计算创面愈合率;伤后3 d,观察并计数创面中大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌菌落数;伤后14 d,行苏木精-伊红染色和Masson染色分别观察并分析创面上皮化的表皮厚度和胶原纤维的光密度;伤后3、7、10 d,采用免疫组织化学法检测创面中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、转化生长因子β1(TGF-β1)及血管内皮生长因子(VEGF)的表达。各指标各时间点创面数均为4个。对数据进行析因设计方差分析、单因素方差分析及Bonferroni校正。结果HA-PBA在波数为1 369、1 425 cm-1处检测到特征峰,表明苯硼酸成功接枝到透明质酸上;HA-DA在波数为1 516、1 431 cm-1处检测到特征峰,表明多巴胺已成功接枝到透明质酸上。含质量分数20%丙烯酰胺的黏性水凝胶在37 ℃下,无论是倾斜还是倒立时都保持稳定不流动的凝胶状态。随着丙烯酰胺含量的增加,黏性水凝胶储存模量和损耗模量均有所增加,但3种不同丙烯酰胺含量黏性水凝胶的储存模量和损耗模量随振荡频率或时间的增加变化不明显且储存模量均大于损耗模量。含银黏性水凝胶中银离子释放长达7 d,累计银离子释放率最高达65%。培养1、2、3 d,含银黏性水凝胶组细胞存活率明显低于PBS组和黏性水凝胶组(P<0.05或P<0.01);培养1 d,黏性水凝胶组细胞存活率明显低于PBS组(P<0.01)。随着伤后时间的延长,3组小鼠创面均不断缩小。伤后3、7、10、14 d,含银黏性水凝胶组创面愈合率分别为(53.0±3.6)%、(75.3±6.9)%、(93.3±1.2)%、(96.7±0.8)%,明显高于生理盐水组的(21.8±6.4)%、(53.9±8.2)%、(72.0±7.8)%、(92.5±0.4)%(P<0.01)。伤后3、14 d,含银黏性水凝胶组创面愈合率明显高于黏性水凝胶组的(43.5±2.4)%、(94.1±1.5)%(P<0.05);伤后3、10 d,黏性水凝胶组创面愈合率明显高于生理盐水组(P<0.01)。伤后3 d,含银黏性水凝胶组创面中2种细菌菌落数明显少于生理盐水组及黏性水凝胶组(P<0.01),黏性水凝胶组创面中2种细菌菌落数明显少于生理盐水组(P<0.05)。伤后14 d,含银黏性水凝胶组创面基本上皮化且表皮厚度更厚,胶原蛋白含量较其他2组明显增多且胶原排列更加有序;含银黏性水凝胶组创面的表皮厚度较其余2组明显增加(P<0.05),胶原纤维光密度较生理盐水组明显增加(P<0.05)。伤后3 d,含银黏性水凝胶组创面TGF-β1和VEGF的表达明显高于生理盐水组(P<0.05或P<0.01),黏性水凝胶组创面VEGF的表达明显高于生理盐水组(P<0.01)。伤后7 d,含银黏性水凝胶组创面TGF-β1的表达明显高于其余2组(P<0.01),VEGF的表达明显高于生理盐水组(P<0.01)。伤后10 d,含银黏性水凝胶组创面TNF-α的表达明显低于生理盐水组(P<0.05),TGF-β1和VEGF的表达明显高于生理盐水组(P<0.05或P<0.01),且VEGF的表达明显高于黏性水凝胶组(P<0.05)。结论本研究制备的含银黏性水凝胶具有良好的稳定性和弹性,可以持续释放银离子,有助于加速小鼠细菌定植全层皮肤缺损创面的愈合,生物毒性较低,可以促进创面再上皮化、胶原沉积和血管再生,可能涉及炎症细胞的浸润与消退。
简介:摘要目的采用89Zr-oxine复合物标记间充质干细胞(MSCs),并探讨其在系统性红斑狼疮(SLE)模型(MRL/lpr小鼠)中的PET显像情况。方法通过18F-FDG PET显像筛选SLE小鼠模型。制备89Zr-oxine用于MSCs的标记,每106个MSCs配置89Zr-oxine 1 MBq。将89Zr-oxine标记的MSCs通过尾静脉分别注射到选出的MRL/lpr小鼠与BALB/c小鼠(均n=5)体内,每只注射1.2×106个标记的MSCs,注射剂量约0.2 MBq,并于注射后2 h、6 h、1 d、3 d、7 d、10 d、14 d分别行microPET显像,计算每克组织百分注射剂量率(%ID/g)。采用两独立样本t检验分析数据。结果成功采用89Zr-oxine标记MSCs,标记效率约20%,细胞活率>90%。MicroPET显像示注射后2 h时主要分布在肺、肝等部位。注射后24 h归巢至MRL/lpr小鼠(n=5)肾脏部位的MSCs数量明显增加,MSCs在MRL/lpr小鼠的肾脏摄取高于BALB/c小鼠的肾脏摄取[(8.28±1.27)与(4.33±0.94) %ID/g;t=3.54,P=0.024]。肾脏摄取先升高再下降后趋于平稳,表明MSCs归巢于肾脏部位。结论成功建立89Zr-oxine标记MSCs的方法。89Zr标记的MSCs可归巢至MRL/lpr小鼠肾脏部位,89Zr标记的MSCs PET显像可用于探索移植MSCs在SLE等疾病治疗过程中的体内分布与迁移等行为。