简介:应用酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母,用以检测类,抗雌激素化合物和环境样品的类,抗雌激素活性.采用多聚酶链反应(PCR)法扩增人雌激素受体(hER)基因,构建诱饵质粒pGBKT7-ERLBD;分别提取并纯化两种含有ER共激活因子基因的靶质粒pGADg24-GRIP1和pGAD424-SRC1;诱饵质粒和靶质粒同时转染酵母细胞Y187,于营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu)上筛选阳性菌落,分别构建两种ER双杂交酵母ER+GRIP1和ER+SRC1.考察双杂交酵母与不同激素:17β-雌二醇(E2)、二氢睾酮(DHT)、孕酮(PG)以及三碘甲状腺原氨酸(T3)的结合情况,并考察了雌激素受体拮抗剂4-羟基他莫昔芬(4-OHT)与酵母的相互作用.结果表明:ER+GRIP1和ER+SRC1酵母均能够专一性的和E2结合,并存在显著的剂量-效应关系,E2对ER+GRIP1和ER+SRC1酵母β-半乳糖苷酶活性诱导的EC50值分别为7.3×10^-11mol·L^-1和1.5×10^-10mol·L^-1,其中ER+GRIP1酵母细胞诱导产生的酶活性值明显高于ER+SRC1-酵母细胞.4-OHT能够抑制E2诱导ER+GRIP1酵母细胞产生的酶活性,并存在显著的剂量-效应关系,IC50值为1.0×10^-7mol·L^-1.表明重组人雌激素受体基因酵母可以用于检测化合物和环境样品的类,抗雌激素活性.
简介:目的:采用Clontech公司第3套酵母双杂交系统,筛选与甲状旁腺素1型受体(PTH1R)相互作用的蛋白。方法:将全长P册JR基因克隆到载体pGBKT7作为诱饵,用LiAc介导将诱饵蛋白质粒pGBKT7-PTHIR和人肾cDNA文库质粒转化到酵母菌AH109中,检测Mell报告基因的表达,并进行相互作用的验证。结果:测序和相互作用验证结果表明SNAPIN在酵母系统中能特异地与PTH1R相互作用;根据对SNAPIN基因的功能分析,其可能与细胞内钙稳态的调控有关。结论:为进一步研究PTH1R促进骨肉瘤进展的机制提供了一定的线索。
简介:目的构建肝再生增强因子的酵母双杂交诱饵质粒,为进一步研究其相互作用蛋白奠定基础。方法将人肝再生增强因子的编码序列重组入pGBKT载体中,经酶切及序列分析鉴定构建正确后,转化酵母AHl09菌株,转化子在SD/-His/-Trp选择培养基上培养;滤纸法β-半乳糖苷酶活性测定;Westemblot检测目的蛋白表达情况。结果正确地构建了人肝再生增强因子的酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-hALR,其酵母AHl09转化菌在SD/-Trp培养基上30℃培养65h,长出φlmm菌落,而在SD/-Trp-His培养基上不生长,β-半乳糖苷酶活性检测呈阴性。Westemblot结果显示目的蛋白以35KD的融合蛋白形式表达。结论诱饵质粒pGBKT7-hALR对宿主菌AHl09没有毒性作用,能稳定表达目的蛋白,不能自身激活报告基因,可用于酵母双杂交的筛选工作。
简介:目的:筛选与癌性锚蛋白重复序列(Gankyrin)相互作用的蛋白。方法:构建诱饵(Bait)质粒pGB-Psmd10-1,采用β-半乳糖苷酶滤膜分析检测其自身转录活性,以Bait质粒筛选人Hela细胞MATCHMAKERcDNA文库,共转染重复验证阳性克隆,并测序鉴定。结果:成功构建Bait质粒,经验证对报告基因LacZ无自激活作用。以Bait质粒筛选人Hela细胞cDNA文库,获得83个克隆,其中5个克隆经重复验证确定为阳性克隆,测序结果显示其cDNA为Psmc4的3段不同剪接体(NM_006503.2,NM_153001.1)。结论:在人Hela细胞中,Psmc4为与Cankyrin相互作用的蛋白。
简介:1904年,世界上第一只小狮虎兽诞生了。随后,我国上海、南京、长沙等地动物园,也有过繁殖“狮虎兽”和“虎狮兽”的经历。南京红山动物园诞生的狮虎兽,创出存活113天的记录。今年5月2日在海南热带野生动植物园,又降生了雄性双胞胎狮虎兽“平平”和“安安”。据了解目前世界上仅有狮虎兽8至10只。