简介:患者女性,30岁,因发作性意识丧失伴肢体强直2年余,于2005年3月22日入院。患者2年前夜间熟睡时自床上摔下,随即意识丧失,双目凝视,牙关紧闭,口吐白沫,四肢强直,持续约50min后自行缓解。此后间隔2~3个月发作1次,每次持续约40~60min。3个月来患者自感左侧面部麻木不适,伴左眼视物模糊。入院查体:双侧瞳孔不等大,右侧直径约2.5mm,对光反射灵敏,左侧直径约3.5mm,对光反射迟钝;右眼视力0.8,左眼0.3;左侧周边视野大部分缺损;左侧颜面部浅感觉减退。CT示左鞍旁有一均匀低密度区,形状不规则,考虑表皮样囊肿。MRI示左颞叶有一占位性病变,呈长T1、长T2信号,大小约4cm×6cm×3cm,考虑左颞叶表皮样囊肿。
简介:目的探索来源于人的表皮细胞的分离培养方法,为其进一步作为皮肤组织工程中的种子细胞或临床应用奠定前期研究基础。方法取3~9岁健康儿童包皮环切术后包皮,经分离酶处理分离真表皮,再将表皮以胰蛋白酶消化为细胞悬液,分别接种于有血清培养基DMEM和无血清培养基K-SFM中进行细胞培养,观察表皮细胞生长融合情况及克隆形成率。结果表皮细胞在DMEM和K-SFM培养液中均能融合成片,但在K-SFM中的融合成片时间明显短于在DMEM中所需时间;在K-SFM中2周时克隆形成率显著高于在DMEM中的克隆形成率。结论两步酶法分离表皮细胞接种于K-SFM中培养,是一种简便有效的表皮细胞分离培养方法。
简介:摘要目的了解树突状表皮T淋巴细胞(DETC)对小鼠创缘表皮细胞增殖和凋亡的影响及其在创面愈合中的作用。方法选取无特殊病原体(SPF)级野生型C57BL/6健康8~12周龄雄性小鼠28只、SPF级8~12周龄T淋巴细胞受体δ敲除(TCR δ-/-)雄性小鼠60只用于如下实验。(1)采用随机数字表法取8只野生型小鼠分离表皮细胞、原代培养DETC,并于培养即刻及培养15、30 d行DETC形态学观察和采用流式细胞仪检测纯度。(2)采用随机数字表法取5只野生型小鼠、5只TCR δ-/-小鼠,分别设为野生型对照组、TCR δ-/-组,每只小鼠背部制作直径6 mm圆形全层皮肤缺损创面。观察伤后即刻及伤后2、4、6、8、10 d创面愈合情况、计算剩余创面面积百分比。(3)同实验(2)取小鼠,分组并制作全层皮肤缺损模型。伤后3 d取创缘组织进行苏木精-伊红染色,检测新生上皮长度。(4)同实验(2)取小鼠,分组并制作全层皮肤缺损模型。伤后3 d取创缘表皮组织,采用蛋白质印迹法检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,评估表皮细胞增殖情况。(5)同实验(2)取小鼠,分组并制作全层皮肤缺损模型。伤后3 d取创缘的表皮组织消化成单细胞悬液,采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。(6)取40只TCR δ-/-小鼠,同前行实验(2)~(5)检测,并采用随机数字表法分为TCR δ-/-对照组和TCR δ-/-+DETC组,每个实验每组5只小鼠。其中小鼠背部同前造成全层皮肤缺损,TCR δ-/-+DETC组小鼠伤后即刻于创缘多点注射1×105个DETC(溶解于100 μL磷酸盐缓冲液,纯度超过90%),TCR δ-/-对照组小鼠同法注射等体积磷酸盐缓冲液。对数据行重复测量方差分析、t检验及Bonferroni校正。结果(1)随着培养时间的延长,DETC树突状突起的数量逐渐增多。培养即刻,4.67%的细胞是T淋巴细胞,这部分T淋巴细胞中94.10%为DETC。培养15 d时DETC纯度达18.50%,培养30 d时DETC纯度达98.70%。(2)伤后即刻,TCR δ-/-组、野生型对照组小鼠的创面情况相似;TCR δ-/-组小鼠伤后2~10 d的创面愈合速度慢于野生型对照组。与野生型对照组小鼠比较,TCR δ-/-组小鼠伤后2、4、6、8、10 d剩余创面面积百分比均明显升高(t=3.492、4.425、4.170、4.780、7.318, P<0.01)。(3)TCR δ-/-组小鼠伤后3 d创缘新生上皮长度为(359±15)μm,明显短于野生型对照组的(462±26)μm(t=3.462,P<0.01)。(4)TCR δ-/-对照组小鼠伤后即刻的创面情况与TCR δ-/-+DETC组相似;TCR δ-/-+DETC组小鼠伤后2~10 d的创面愈合速度明显快于TCR δ-/-对照组。与TCR δ-/-对照组比较,TCR δ-/-+DETC组小鼠伤后2、4、6、8、10 d剩余创面面积百分比明显降低(t=2.308、3.725、2.698、3.707、6.093, P<0.05或P<0.01)。(5)TCR δ-/-+DETC组小鼠伤后3 d创缘新生上皮长度为(465±31)μm,明显长于TCR δ-/-对照组的(375±21)μm(t=2.390,P<0.05)。(6)伤后3 d,TCR δ-/-组小鼠创缘表皮细胞的PCNA表达量为1.25±0.04,明显低于野生型对照组的2.01±0.09(t=7.415,P<0.01)。(7)伤后3 d,TCR δ-/-+DETC组小鼠创缘表皮细胞的PCNA表达量为1.62±0.08,明显高于TCR δ-/-对照组的1.05±0.14(t=3.561,P<0.05)。(8)伤后3 d,TCR δ-/-组小鼠创缘表皮细胞凋亡率为(16.1±1.4)%,明显高于野生型对照组的(8.1±0.6)%(t=5.363,P<0.01)。(9)伤后3 d,TCR δ-/-+DETC组小鼠创缘的表皮细胞凋亡率为(11.4±1.0)%,明显低于TCR δ-/-对照组的(15.4±1.4)%(t=2.377,P<0.05)。结论DETC可通过促进小鼠创缘表皮细胞的增殖、抑制其凋亡,参与创面愈合过程。
简介:目的:检测人表皮细胞中是否存在侧群(sidepopulation,SP)细胞,并研究该表型细胞是否表达通用干细胞标志物ABCG2和表皮干细胞的标志物整合素α6和β1。方法:运用中性蛋白酶和胰蛋白酶两步消化法从手术切除的人包皮组织中分离获得表皮细胞。经Hoechst33342荧光染料和PI染色,流式细胞仪分析并分选SP细胞。采用流式细胞仪分析SP细胞ABCG2、整合素α6和β1的表达情况。结果:人表皮细胞中存在SP细胞,其比例为0.2%~0.3%。用流式细胞仪可检测到在SP细胞以及总表皮细胞中均有少量细胞表达通用干细胞标志物ABCG2以及表皮干细胞的标志物整合素α6和β1,但二者阳性细胞百分比差异无统计学意义(P〉0.05)。结论:表皮细胞中的SP细胞是否是富集的表皮干细胞仍存在疑问,还需要进一步的动物体内移植实验、克隆形成能力和增殖能力的研究证实。
简介:目的通过探索体外诱导表皮干细胞向汗腺上皮分化可能性,为汗腺组织工程探索新的种子细胞来源。方法分别收集正常皮肤表皮细胞.利用流式细胞仪多参数分选表皮干细胞;于不同时间点连续观察,不同浓度EGF(50~1000ng/mL)作用于表皮干细胞后的细胞生长动力学变化,免疫荧光鉴定汗腺细胞表型(NHE-1,NKCC-1)流式细胞仪分析不同浓度EGF对于细胞的毒性。结果50ng/mL和100ng/mLEGF对表皮细胞促增殖能力明显,且二者无显著差异(P〉0.05):500ng/mL和1000ng/mLEGF抑制细胞增殖。1000ng/mLEGF对细胞增殖的抑制作用更明显(P〈0.05)。表皮干细胞经过50ng/mLEGF诱导后表达汗腺上皮相对特异性标记NHE-1及NKCC-1。结论表皮干细胞可成为汗腺组织工程种子细胞的重要来源。50ng/mlEGF可作为相对优化的表皮干细胞诱导条件。
简介:目的:对大肠杆菌表达的人源重组肝细胞生长肽进行分离纯化获得目的蛋白rhALR。方法:其表达产物在大肠杆菌中以不溶性包含体形式存在,经过超声破菌、包含体抽提、洗涤处理、使包含体纯度达75%以上,用8mol/L尿素变性溶解包含体沉淀后上清直接稀释复性,再经浓缩、透析、离子交换凝胶过滤等系列纯化步骤。结果:纯化后目的蛋白纯度达95%以上。回收率达20%。
简介:摘要目的探讨生物强度电场对人表皮细胞株HaCaT和小鼠表皮细胞运动性及CD9表达的调节作用。方法采用实验研究方法。取对数生长期人永生化表皮细胞株HaCaT细胞及分离自16只1~3 d龄雌雄不拘BALB/c小鼠的原代表皮细胞进行实验。将HaCaT细胞分为200 mV/mm电场强度处理3 h的加电组和模拟处理的假电组,在活细胞工作站中观察细胞迁移(运动方向、位移速度、轨迹速度,加电组样本数为46、假电组样本数为34)及排列,免疫荧光法检测CD9蛋白的分布及表达。将HaCaT细胞与小鼠表皮细胞均分为假电组(模拟处理)和进行相应电场强度处理3 h的50 mV/mm组、100 mV/mm组、200 mV/mm组、400 mV/mm组,将HaCaT细胞与小鼠表皮细胞均分为未行处理的空白对照组和用200 mV/mm电场强度分别处理相应时间点的1 h组、3 h组、6 h组,蛋白质印迹法检测CD9的蛋白表达(样本数为3)。对数据行Mann-Whitney U检验、单因素方差分析、独立样本t检验及LSD检验。结果处理3 h内,加电组HaCaT细胞明显趋向负极移动,假电组HaCaT细胞围绕原点随机运动;与假电组比较,加电组HaCaT细胞方向性显著增强,位移速度、轨迹速度显著加快(Z=-3.975、-6.052、-6.299,P<0.01)。处理3 h后,加电组HaCaT细胞长轴与电场方向垂直,假电组HaCaT细胞呈任意取向排列。处理3 h后,加电组HaCaT细胞CD9蛋白(均位于细胞膜上)相对表达量明显低于假电组(t=4.527,P<0.01)。处理3 h后,假电组、50 mV/mm组、100 mV/mm组、200 mV/mm组、400 mV/mm组HaCaT细胞、小鼠表皮细胞CD9蛋白表达量分别为0.332±0.021、0.283±0.032、0.254±0.020、0.231±0.041、0.212±0.031与0.565±0.021、0.453±0.022、0.389±0.020、0.338±0.021、0.233±0.011。对于2种细胞而言,与假电组比较,电场处理4组细胞CD9蛋白表达量均明显降低(P<0.01);与50 mV/mm组比较,另外3个电场强度处理组细胞CD9蛋白表达量均明显降低(P<0.01);与100 mV/mm组比较,200 mV/mm组、400 mV/mm组细胞CD9蛋白表达量均明显降低(P<0.01);与200 mV/mm组比较,400 mV/mm组细胞CD9蛋白表达量明显降低(P<0.01)。空白对照组、1 h组、3 h组、6 h组HaCaT细胞、小鼠表皮细胞CD9蛋白表达量分别为0.962±0.031、0.784±0.020、0.531±0.021、0.409±0.011与0.963±0.031、0.872±0.031、0.778±0.040、0.591±0.041。对于2种细胞而言,与空白对照组比较,1 h组、3 h组、6 h组细胞CD9蛋白表达量均明显降低(P<0.01);与1 h组比较,3 h组、6 h组细胞CD9蛋白表达量均明显降低(P<0.05或P<0.01);与3 h组比,6 h组细胞CD9蛋白表达量明显降低(P<0.01)。结论生物强度电场可使HaCaT细胞发生定向迁移和排列,可下调HaCaT细胞和小鼠表皮细胞中CD9的表达,且呈电场强度与处理时间依赖性。
简介:法国科学家首次成功的利用人类干细胞制造出了一块完整的表皮。法国科学家首次成功的利用人类干细胞制造出了一块完整的表皮,该成果可缩短重度烧伤患者等待皮肤移植手术的时间,减小感染的几率,从而挽救病人生命。科学家希望这种干细胞疗法未来可成为重度烧伤患者和遗传性皮肤病患者的替代疗法。相关研究成果发表于11月份的英国《柳叶刀》杂志上。此项研究由法国I-STEM研究所负责,该所主要使用干细胞来开发再生疗法。所长马克·佩先斯基称,人类干细胞具有无限增殖的能力和分化为机体各种细胞的多能性。在实验中,研究人员首先从人类皮肤干细胞中提取出了角质生成细胞,它可以使皮肤不断更新;然后,研究人员分别在体外和生物体上对分离出来的角质生成细胞重组形成功能性表皮细胞的能力进行了测试;接下来,在细胞生物学和药理学方法的支持下,研究人员在体外成功地利用角质生成细胞重建出了一块表皮,并将获得的表皮移植到实验小鼠背部的伤口上。移植后12周,小鼠移植表皮的局部皮肤区域完全恢复正常。佩先斯基表示,在传统的手术中,皮肤移植一般取用病人自己的皮肤组织,而且完成移植需要3周时间,对于很多严重烧伤的人来说,这个过程太漫长。每年,在法国都有200人到300人死于重...
简介:目的了解皮肤软组织扩张术后表皮干细胞(ESC)的分化和分布情况,初步探讨扩张皮肤组织的相关生长机制。方法取15例行Ⅱ期头、颈部皮肤扩张术患者扩张后(平均注水期45d)皮肤标本及正常皮肤标本,按取材部位分为:(1)头部近扩张器中心组:取与扩张器中轴线垂直距离为3cm处的扩张后头皮;(2)头部扩张器侧壁组:取与扩张器中轴线垂直距离为5-7cm的扩张后头皮;(3)颈部扩张皮肤组;(4)未扩张头皮对照组;(5)未扩张颈部皮肤对照组。各组皮肤标本行HE染色观察组织结构,行免疫组织化学染色观察细胞角蛋白19(CK19)阳性细胞的分化及分布特征。结果与2个未扩张对照组比较,HE染色可见各扩张组表皮层凹凸不平且相对增厚,皱褶明显,细胞层次增多;细胞呈密集分布,以靠近基底层最为显著,但排列欠整齐,极性过度不明显。免疫组织化学染色显示,各扩张组基底层CK19阳性细胞的连续性基本存在,基底层个别部位阳性细胞明显增多,呈复层排列;基底层之外亦有少量成团或散在分布的CK19阳性细胞。2个未扩张对照组未见上述现象。结论皮肤软组织扩张后,ESC在修复过程中增殖和分化加强,并出现异位分布。
简介:摘要目的探讨树突状表皮T细胞(DETC)调节小鼠表皮干细胞增殖和分化,促进小鼠全层皮肤缺损创面愈合的机制。方法(1)取10只8周龄野生型雄性C57BL/6(品系和性别下同)小鼠,剪取整块背部皮肤,分离培养DETC。取5只8周龄野生型小鼠设为野生对照组,5只8周龄T细胞受体(TCR)δ-/-型小鼠设为TCRδ-/-对照组,于背部脊柱线两侧各制作一个直径为6 mm的全层皮肤缺损创面,伤后不做任何处理。另取15只8周龄TCRδ-/-型小鼠,按随机数字表法(分组方法下同)分为磷酸盐缓冲液(PBS)组、DETC组和胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)组,每组5只,同前制作全层皮肤缺损创面,伤后即刻,分别于每个创面周围皮下注射10 μL无菌PBS、DETC(细胞浓度为1×106个/mL)、5 mg/mL重组小鼠IGF-Ⅰ。伤后2、4、6、8 d,计算剩余创面面积百分比。(2)取3只8周龄野生型小鼠,设为野生对照组。另取9只8周龄TCRδ-/-型小鼠,分为TCRδ-/-对照组、PBS组和DETC组,每组3只,同实验(1)制作全层皮肤缺损创面。伤后3 d,化学发光成像分析仪检测创缘表皮组织IGF-Ⅰ蛋白表达水平。(3)取3只8周龄野生型小鼠,设为野生对照组。另取6只8周龄TCRδ-/-型小鼠,分为PBS组和DETC组,每组3只,同实验(1)制作全层皮肤缺损创面。伤后3 d,取创缘表皮组织,分离DETC,流式细胞仪检测表达IGF-Ⅰ的DETC百分比。(4)同实验(2)取小鼠并分为野生对照组、PBS组、DETC组、IGF-Ⅰ组,在任意一侧耳朵朝内耳方向做一长3 cm的直线切口,深达皮肤全层。野生对照组小鼠伤后不进行任何处理,DETC组、IGF-Ⅰ组、PBS组小鼠伤后即刻分别于创面周围皮下注射10 μL DETC(细胞浓度为1×106个/mL)、5 mg/mL重组小鼠IGF-Ⅰ、无菌PBS。伤后12 d,取创缘表皮组织,免疫荧光染色观察角蛋白15阳性细胞数。(5)同实验(4)取小鼠并进行分组、处理。伤后12 d,取创缘表皮组织,免疫荧光染色观察角蛋白10阳性细胞数。(6)取20只3 d龄野生型小鼠(下同),每个指标检测取5只,剪取全身皮肤,分离培养表皮干细胞,分为对照组、DETC共培养组。DETC共培养组细胞加入1 mL DETC(细胞浓度为1.25×106个/mL),对照组细胞加入1 mL DETC培养基,培养3 d,流式细胞仪(下同)检测5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)阳性细胞百分比;培养5 d,检测CD49f+CD71-细胞百分比、角蛋白14阳性细胞百分比;培养10 d,检测角蛋白10阳性细胞百分比。(7)取20只小鼠,每个指标检测取5只,分离培养表皮干细胞,分为对照组和IGF-Ⅰ组。IGF-Ⅰ组细胞加入1 mL重组小鼠IGF-Ⅰ(10 ng/mL),对照组细胞加入1 mL无菌PBS,同实验(6)检测EdU阳性细胞百分比、CD49f+CD71-细胞百分比、角蛋白14阳性细胞百分比、角蛋白10阳性细胞百分比。实验(6)和(7)各组样本数均为3。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析、t检验。结果(1)伤后4、6、8 d,TCRδ-/-对照组小鼠剩余创面面积百分比显著高于野生对照组(t=2.78、3.39、3.66,P<0.05或P<0.01);DETC组、IGF-Ⅰ组小鼠剩余创面面积百分比显著低于PBS组(t=2.61、3.21、3.88,2.84、2.91、2.49,P<0.05或P<0.01)。(2)伤后3 d,TCRδ-/-对照组小鼠创缘表皮组织中IGF-Ⅰ蛋白表达水平显著低于野生对照组(t=17.34,P<0.01)。DETC组小鼠创缘表皮组织中IGF-Ⅰ蛋白表达水平显著高于PBS组(t=11.71,P<0.01)。(3)伤后3 d,PBS组小鼠创缘表皮组织中表达IGF-Ⅰ的DETC百分比显著低于野生对照组和DETC组(t=24.95、27.23,P<0.01)。(4)伤后12 d,PBS组小鼠创缘表皮组织中角蛋白15阳性细胞数显著少于野生对照组、DETC组和IGF-Ⅰ组(t=17.97、11.95、7.63,P<0.01)。(5)PBS组小鼠创缘表皮组织中角蛋白10阳性细胞数显著多于野生对照组、DETC组和IGF-Ⅰ组(t=11.59、9.51、3.48,P<0.05或P<0.01)。(6)DETC共培养组培养3 d EdU阳性细胞百分比、培养5 d CD49f+CD71-细胞百分比、培养5 d角蛋白14阳性细胞百分比分别为(43.5±0.6)%、(66.5±0.5)%、(69.3±1.7)%,显著高于对照组的(32.3±1.3)%、(56.4±0.3)%、(54.9±1.3)%,t=7.97、17.10、6.66,P<0.01。DETC共培养组培养10 d角蛋白10阳性细胞百分比为(55.7±0.7)%,显著低于对照组的(67.1±1.2)%,t=8.34, P<0.01。(7)IGF-Ⅰ组培养3 d EdU阳性细胞百分比、培养5 d CD49f+CD71-细胞百分比、培养5 d角蛋白14阳性细胞百分比分别为(42.1±0.9)%、(81.1±1.3)%、(66.8±1.0)%,显著高于对照组的(32.4±0.7)%、(74.9±0.7)%、(52.0±1.9)%,t=8.39、4.24、7.25,P<0.05或P<0.01。IGF-Ⅰ组培养10 d角蛋白10阳性细胞百分比为(53.5±1.1)%,显著低于对照组的(58.2±0.3)%,t=3.99, P<0.05。结论DETC通过分泌IGF-Ⅰ促进表皮干细胞的增殖和抗凋亡潜能并抑制其向终末期细胞分化,从而促进小鼠全层皮肤缺损创面愈合。
简介:目的根据毛囊形成原理,以人毛乳头细胞和表皮细胞为种子细胞,构建带附属器的组织工程皮肤替代物。方法分实验组和对照组,实验组皮肤替代物真皮层接种人毛乳头细胞和表皮细胞;对照组真皮层不接种任何细胞。在裸鼠背部作一圆形全层皮肤缺损,将两组皮肤替代物气一液界面培养5d后移植到裸鼠背部。观察创面愈合情况.并在移植后第4、6、8周取材,进行组织学观察。结果皮肤替代物移植后2周.实验组创面已完全愈合,移植后4周对照组创面才完全愈合,并且对照组创面收缩比实验组明显。移植后6周,实验组真皮层内见到毛囊样结构和皮脂腺结构.对照组未见毛囊样结构和皮脂腺样结构。结论将人的毛乳头细胞和表皮细胞共同种植在皮肤替代物的真皮层.可以构建出带附属器的组织工程皮肤替代物.这种替代物对创面的修复能力更强。