简介：

简介：目的：拼接DNA片段并克隆。方法：用T4DNA连接酶将DNA片段以平末端随机连接,随后用限制性内切酶切割,琼脂糖电泳分离酶切产物,挑选特定片段纯化回收,与线性化的载体质粒连接,转化大肠杆菌感受态细胞。结果：通过以上步骤,成功拼接了不同DNA片段,构建了含有目的拼接片段的重组质粒。结论：该方法简便、易行、可靠,可作为拼接、克隆DNA的备选方案,在分子生物学研究和基因工程中应用。

简介：

简介：[摘要] 目的 探讨肿瘤DNA重组修复功能评估系统（RDS）预测非小细胞肺癌（NSCLC）患者放化疗疗效的价值。方法 选取2019年1月-2022年1月医院收治的100例非小细胞肺癌患者，所有患者均接受放化疗治疗，于于放疗2个月、化疗2个周期后对患者随访1个月评估两组治疗效果，根据结果分为有效组与无效组，设计基线资料调查表，详细统计两组患者的基线资料及RDS值并比较，重点分析RDS值预测NSCLC患者放化疗疗效的价值。结果 治疗后，100例NSCLC患者中CR 0例，PR 42例，SD 30例，PD 28例，治疗有效72例，占比72.00%，治疗无效28例，占比28.00%；无效组RDS值比有效组低，有统计学差异（P＜0.05），组间其他资料比较，无统计学差异（P＞0.05）；绘制ROC曲线结果显示，RDS值预测NSCLC患者放化疗治疗无效风险的AUC=0.813，预测价值理想，对应灵敏度为0.759、特异度为0.810、约登指数为0.569、cut-off值为1.242。结论 RDS值预测NSCLC患者放化疗治疗无效风险价值较高，RDS值过表达提示NSCLC患者放化疗治疗无效高风险。

简介：摘要目的探讨TAB182促进同源重组(HR)修复的相关调控分子及机制。方法利用shRNA敲低人乳腺癌MCF-7细胞中的TAB182基因，TAB182敲低的MCF-7细胞为沉默组，使用shRNA阴性对照物的MCF-7细胞为TAB182阴性对照组。通过RNA测序分析，筛选与TAB182相关差异表达的HR修复基因。qRT-PCR验证相关基因的mRNA表达，Western blot验证相关蛋白的表达。RAD51和BrdU免疫荧光检测DNA断裂末端形成的3′单链DNA(ssDNA)；流式细胞术检测细胞周期阻滞和细胞凋亡；集落形成实验检测细胞的放射敏感性。结果RNA测序分析和qRT-PCR验证结果一致，TAB182沉默组细胞中RPA2的mRNA表达降低(t＝17.97，P<0.05)。相比于TAB182阴性对照组细胞，TAB182沉默组细胞RPA2在蛋白水平也显著减少。相比于TAB182阴性对照组，TAB182沉默组细胞中RAD51焦点(foci)的表达显著降低；3′ ssDNA结合蛋白标志物BrdU在TAB182沉默组细胞的细胞核中foci形成显著减少。在放射菌素D作用后的第4、8、12 h，相比于TAB182阴性对照组，TAB182沉默组细胞RPA2 mRNA的衰减加快(t＝5.37、3.79、3.69，P<0.05)。相比于TAB182阴性对照组，TAB182沉默组细胞放射敏感性增加(t＝3.48，P<0.05)；且TAB182沉默组放射诱发的凋亡率显著增加(t＝11.05，P<0.05)、照射后24 h的周期阻滞时间延长(t＝8.40，P<0.01)。结论TAB182通过维持RPA2 mRNA的稳定性，促进RPA2的表达，在DSBs的同源重组修复通路中发挥作用。TAB182的缺失可增强肿瘤细胞的放射敏感性。

简介：摘要面对各种因素导致的DNA损伤，细胞有一套应答修复机制。其中细胞周期阻滞在DNA损伤应答修复中扮演了重要角色，为修复受损DNA创造了条件。关于细胞周期调控的研究集中于细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK）与细胞周期检查点等方面。在DNA损伤修复过程中，损伤位点募集的磷脂酰肌醇-3-激酶样激酶（PIKKs）可引起细胞周期检查点相关蛋白的激活，导致细胞周期阻滞。在碱基切除修复、核苷酸切除修复、错配修复、DNA双链断裂修复等常见的DNA损伤修复途径中，招募的损伤修复相关蛋白在细胞周期调控中也起到一定的作用。因此综述了主要DNA损伤修复形式与细胞周期阻滞之间的关系及研究进展。

简介：1题目人类疾病的转基因动物模型常用于致病机理的探讨及治疗药物的筛选。利用正常大鼠制备遗传性高血压转基因模型大鼠的流程如图2所示。

简介：摘要DNA损伤修复（DDR）基因在肝癌中存在过表达的现象。研究发现，DDR与肝癌的发生与发展有密切的联系。DDR抑制剂与肝癌化疗、靶向治疗药物间存在协同作用，其可增强放疗的敏感性。部分DDR基因可作为肝癌预后评估的生物标志物。

简介：当前手术不可能彻底治愈恶性胶质瘤,因此辅助治疗就非常重要,目前最为成熟、应用最多的是放疗和化疗,化疗和放疗的本质是造成DNA的损伤,导致细胞死亡或凋亡,从而达到治疗的目的.然而,一方面,任何细胞在DNA遭受损伤后都会启动一定的修复机制,使细胞免于死亡;另一方面,不同的细胞其DNA修复的能力存在着差异,正常细胞DNA修复能力略强于肿瘤细胞.DNA修复靶向治疗的实质是扩大这种DNA修复能力的差距,加强对肿瘤细胞的损伤,从而提高治疗的效能.本文就DNA损伤修复靶向治疗胶质瘤作一综述.

简介：摘要目的探究miR-375-3p调控结直肠癌细胞放射敏感性的作用和机制。方法在结直肠癌细胞HCT116及HT29中过表达miR-375-3p，利用CCK-8法检测细胞增殖能力，利用克隆形成实验检测细胞克隆形成能力，利用Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡，利用流式细胞术检测细胞周期分布。过表达miR-375-3p后，检测γ-H2AX foci形成点数量、同源重组(HR)及非同源性末端连接(NHEJ)修复效率，分析miR-375-3p表达对DNA双链断裂(DSBs)以及其修复效率的影响；利用生物信息学预测miR-375-3p在HR修复通路中的下游靶基因，利用双荧光素酶报告基因法进一步验证miR-375-3p表达对靶基因重组蛋白A (RAD51)表达调控作用。最后，利用荧光定量PCR技术检测经60Co γ射线2、6 Gy照射后HCT116细胞miR-375-3p的表达量；抑制miR-375-3p表达，经0、1、2、4、6 Gy不同剂量照射后，分析miR-375-3p表达变化对结直肠癌细胞HCT116放射敏感性的影响。结果过表达miR-375-3p显著抑制了结直肠癌细胞HCT116及HT29的增殖及克隆形成能力，诱发其细胞凋亡、G1期周期阻滞和DSBs损伤，下调了Rad51表达，显著降低了HR修复效率[miR-375-3p(3.55 ± 0.30)%，miR-nc(1.97 ± 0.15)%；t＝10.055，P<0.05]；双荧光素酶报告基因实验显示miR-375-3p能够靶向Rad51 3′UTR区域结合(t＝5.013，P<0.05)；电离辐射能诱导miR-375-3p表达，抑制其表达显著降低了结直肠癌细胞放射敏感性(t＝6.460、5.619、10.150，P<0.05)。结论miR-375-3p能够靶向抑制Rad51表达，下调DSBs的HR修复效率，增强结直肠癌细胞的放射敏感性。

简介：DNA常受到内源性细胞代谢产物、外源性化学物质和辐射等损伤。不同修复途径可修复各种损伤的DNA,从而维持基因组的完整性,预防基因突变。近年发现,MUS81基因表达的蛋白质与生物的DNA修复息息相关,在DNA重组修复中起极重要的作用。由于MUS81被发现较晚,目前人们对其研究尚处起步阶段。本文结合近年国内外相关文献报道，综述如下。

简介：摘要目的探讨DNA损伤修复因子DNA损伤特异性结合蛋白1（DDB1）在肝癌组织中的表达情况及DDB1基因沉默对人肝癌SMMC-7721细胞DNA损伤修复和靶向杀伤作用的影响。方法利用UALCAN平台对癌症基因组图谱（TCGA）数据库中肝细胞肝癌组织（371例）和癌旁组织（50例）中DDB1的表达情况及DDB1表达与肝癌患者总生存的相关性进行生物信息学分析。向SMMC-7721细胞转染靶向DDB1的小干扰RNA（siRNA）和阴性对照siRNA，分别为DDB1沉默组和阴性对照组。用X线照射诱导两组细胞外源性DNA双链断裂（DSB）损伤，采用免疫荧光染色（γH2AX用于评估DSB损伤情况，RPA32s33和Rad51用于评估同源重组修复情况）和蛋白质印迹法（检测RPA32s33蛋白水平）分析DDB1基因沉默对细胞DSB损伤修复的影响。采用姐妹染色体交换（SCE）实验分析DDB1沉默组和阴性对照组细胞同源重组SCE频率。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法分析PARP抑制剂奥拉帕尼（10 μmol/L）、顺铂（1 μg/ml）及二者联合杀伤DDB1沉默组和阴性对照组SMMC-7721细胞的效果。结果生物信息学分析发现，肝癌组织DDB1 mRNA水平较癌旁组织高（P<0.001），DDB1高表达患者总生存较DDB1低表达患者差（P=0.029）。X线照射后培养24 h，阴性对照组细胞γH2AX灶点已大多消退，DDB1沉默组细胞仍较多[每个细胞中（5.1±2.0）个比（13.4±2.0）个，t=-5.08，P=0.007]。X线照射后培养4 h，阴性对照组RPA32s33灶点数[每个细胞中（30.8±5.0）个比（13.2±1.6）个]和Rad51灶点数[每个细胞中（19.5±1.8）个比（8.3±3.3）个]均高于DDB1沉默组，两组间差异均有统计学意义（均P<0.01）。阴性对照组SCE频率高于DDB1沉默组[（21.2±3.0）%比（11.2±1.6）%，t=5.07，P=0.007]。MTT法检测显示，奥拉帕尼作用后，DDB1沉默组细胞的存活率低于阴性对照组[（40.3±3.6）%比（79.8±1.3）%，t=17.94，P<0.001]，奥拉帕尼联合顺铂时，两组细胞存活率均进一步降低，且DDB1沉默组细胞存活率低于阴性对照组[（10.2±2.8）%比（29.6±3.4）%，t=7.72，P=0.002]，顺铂单独作用时，DDB1沉默组和阴性对照组细胞存活率差异无统计学意义[（41.9±5.1）%比（49.8±3.3）%，t=2.71，P=0.054]。结论DDB1在肝癌组织中高表达，可能是肝癌治疗抵抗和预后较差的重要因素。敲低DDB1基因表达能促进肝癌SMMC-7721细胞对PARP抑制剂的敏感性，其机制很可能与DDB1沉默引起SMMC-7721细胞的同源重组修复缺陷有关。

简介：

简介：摘要目的探讨自噬介导的乙型脑炎重组DNA疫苗对BALB/c小鼠体内树突状细胞(dendritic cells，DCs)免疫相关功能的影响。方法取健康BALB/c雌性小鼠，随机分配成5组，分别用pcDNA3.1(＋)空载体、pJME质粒、pJME-LC3重组质粒肌注免疫小鼠，并使用无菌PBS肌注作为空白对照组，乙型脑炎减毒活疫苗腹腔注射作为阳性对照组，免疫注射共3次，每次间隔2周，末次免疫2周后无菌取小鼠脾脏，研磨后从单细胞悬液中分离DCs，使用免疫荧光技术观察重组质粒在DCs中的表达水平；利用流式细胞术检测DCs表面主要组织相容性复合体Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ，MHCⅡ)的表达水平以及小鼠脾脏DCs摄取FITC-Dextran后的平均荧光强度；CCK8法检测分析不同免疫组DCs对同种异体小鼠脾脏淋巴细胞的刺激增殖效果。结果相对于其他免疫组，pJME-LC3实验组大量DCs胞质中可见质粒编码蛋白表达；pJME-LC3实验组免疫鼠脾脏DCs摄取FITC-Dextran的能力明显强于其他免疫组(P<0.05)；pJME-LC3组小鼠成熟DCs表面MHCⅡ分子的表达水平明显升高(P<0.05)；进一步研究发现pJME-LC3组小鼠脾脏DCs对同种异体小鼠脾脏淋巴细胞刺激增殖能力高于其他免疫组(P<0.05)。结论pJME-LC3重组质粒可以促进免疫鼠脾脏DCs抗原提呈以及刺激淋巴细胞增殖的能力，提示自噬介导的乙型脑炎重组DNA疫苗可能通过影响BALB/c小鼠DCs功能促进免疫效应。

简介：目的探讨DNA损伤修复相关因子组蛋白H2AX和毛细血管扩张性共济失调突变因子(ataxiatelangiectasiamutation,ATM)在宫颈癌组织中的表达水平及诊断意义。方法选取2016年1月~2017年7月我科宫颈癌30例(宫颈癌组),同时选取非宫颈癌18例为对照组,对宫颈癌组和对照组宫颈组织进行HE染色和免疫组化染色,在mRNA水平检测H2AX和ATM的表达情况,以磷酸化抗体检测磷酸化H2AX(7H2AX)与磷酸化ATM(phospho-ataxiatelangiectasiamutation,pATM)水平。结果荧光定量PCR分析宫颈癌组ATMmRNA为2.8546±0.8881,明显高于对照组1.0018±0.4980(f=9.256,P=0.000);宫颈癌组H2AXmRNA为2.4312±0.8224,显著高于对照组0.7896±0.4791(t=8.738,P=0.000)。7mAX和pATM主要在细胞核中表达,7mAX阳性率80.0%(24/30),显著高于对照组11.1%(2/18)(Z=_3.381,P=0.000);宫颈癌组pATM阳性率83.3%(25/30),显著高于对照组16.7%(3/18)(Z=-4.031,P=0.000)。结论7H2AX和pATM在宫颈癌中高表达,作为DNA损伤修复因子对宫颈癌的早期诊断有一定的临床意义。

简介：目的研究褪黑素早期干预对大鼠局灶性脑缺血再灌注DNA损伤和修复关键蛋白-XRCC1的影响。方法应用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，将90只大鼠随机分为褪黑素干预组（30只）、缺血组（30只）和假手术组（30只）。褪黑素干预组术前30min腹腔注射褪黑素按10mg／kg给药。利用单细胞凝胶电泳、免疫组织化学法，测定褪黑素早期干预后脑缺血再灌注DNA单链断裂和XRCC1的情况。结果XRCCl免疫组织化学显示，在各时相点褪黑素干预组的XRCC1蛋白含量均高于缺血组[缺血2h再灌注10min（70．4±6．3vs59.4±3．6）；1h（32±5．1vs24±2．9）；4h（25±3．5vs11±2．9）；12h（17．4±5．6vs9．1±1．58）；24h（10、6±1．8vs7．2±1．9）；48h（8．0±1．6vs5.2±1．3）]，DNA单链断裂轻于缺血再灌注对照组，并且在各时相点均有显著差异[缺血2h再灌注10min（10．4±3.7vs13．4±3．8）；1h（11．2±2．3vs18.7±5．9）；4h（19．7±3．4vs33．6±9．2）；12h（24．9±3．8vs42．9±13．5）；24h（17．4±4．3vs27．5±4．8）；48h（15．5±2．7vs25．4±6．6）]。结论褪黑素对于脑缺血再灌注DNA单链断裂有保护作用，可能是减少XRCC1的降低。

简介：无

简介：摘要 目的：研究重组Ⅲ型人源化胶原蛋白敷贴对皮肤创面的修复效果。方法：选取40例皮肤存在创口的患者作为研究对象，依据随机数字表法分为观察组与对照组，各20例。对照组给予CO2激光治疗，观察组在对照组基础上使用重组Ⅲ型人源化胶原蛋白敷贴，比较并评估两组的创面愈合时间、创面面积、缩小率以及抑制色素沉着和瘢痕形成的作用。结果：观察组治疗9 d就有患者痊愈，对照组没有患者痊愈，观察组1个疗程痊愈率较对照组高70％，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）；观察组在每个时间点上的创面总面积平均值都比对照组小，在治疗12 d后两组创面面积的差异有统计学意义（P ＜ 0.05）；治疗9 d后观察组的创面面积缩小率明显高于对照组，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）；观察组显著抑制创面色素沉着、瘢痕形成的作用好于对照组；重组Ⅲ型人源化胶原蛋白敷贴在本研究中没有引发任何不良反应。结论：重组Ⅲ型人源化胶原蛋白敷贴在创面修复愈合中显示出较好的疗效，并且在一定时间范围内能够促进创面的痊愈和收缩并具有良好的安全性。

简介：目的：探讨PEI作为免疫佐剂对G250抗原肽基因PVAX1/C-G250肽-C免疫保护效果的增强作用及联合应用CAIX蛋白疫苗进行PRIME—BOOST免疫程序免疫增强效果。方法：用EcoRI、XhoI和EcoRI、SalI分别双酶切PVAX1及既往构建的pET28a（＋）/C-G250肽-C质粒。利用DNA重组技术构建重组质粒PVAX1/C-G250肽-C,酶切分析鉴定。大量提取质粒并分光光度计测质粒含量。将32只雌性昆明小鼠随机分为（A）裸DNA组,（B）DNA-PEI复合物组,（C）DNA-PEI＋蛋白疫苗组,（D）空白对照组。按0,10,20,30天程序经股四头肌注射免疫。C组在第20天及第30天进行蛋白冲击。初次免疫前和第40天鼠尾取血,ELISA法检测抗体滴度。流式细胞术测淋巴细胞亚群CD4＋和CD8＋。结果：酶切及基因测序鉴定证实G250抗原肽cDNA正确插入PVAX1/C-G250肽-C真核表达的重组质粒中。昆明小鼠经4次免疫后,3个实验组都产生了特异性的体液和细胞免疫反应,B组的抗体滴度1：1.28×104及CD4＋、CD8＋达26.12%和12.60%,明显高于A组的1：3.2×103和CD4＋,CD8＋占到19.32%和10.74%。而蛋白冲击组的1：5.12×104和CD4＋,CD8＋占到41.96%和15.14%,明显高于B组（P〉0.05）。结论：成功构建重组质粒PVAX1/C-G250肽-C。该DNA疫苗与PEI和G250蛋白疫苗联合使用后产生极强的免疫原性,诱导产生了高滴度、高特异性抗体及细胞免疫反应。证实G250DNA疫苗联合PEI使用并进行蛋白疫苗冲击的免疫策略可产生强大的免疫保护作用。为恶性肿瘤的术后辅助治疗提供新的思路和方法。

简介：摘要：目的：建立大肠杆菌表达的重组蛋白外源性E.coli宿主残留DNA的检测方法用于生产过程以及最终产品的质量控制。方法：参考试剂盒相关说明书，样品加标回收了率无法达到2020版中国药典（Ch.P）第四部3407章节和美国药典(USP)1130章节的要求，通过对药物浓度、处理温度、糖原的蛋白酶K的使用量以及不同的加标量的优化，即将样品稀释10倍后，加30pg的E.coli标准品，20μl的蛋白酶K消化1h,选择15μl PCR反应体系。结果：回收率满足在50%~150%之间。结论：借助商品化的试剂盒，优化的外源性DNA提取条件满足法规要求、操作简便，非常适用于大肠杆菌表达的重组蛋白生产过程以及最终产品的外源性残留DNA的检测。