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  • 简介:Honeybees(Apismellifera)havehaplodiploidsexdetermination:malesdevelopfromunfertilizedeggsandfemalesdevelopfromfertilizedones.Thedifferencesinlarvalfoodalsodeterminethedevelopmentoffemales.Herewecomparedthetotalsomaticgeneexpressionprofilesof2-dayand4-day-olddrone,queenandworkerlarvaebyRNASeq.Theresultsfromaco-expressionnetworkanalysisonallexpressedgenesshowedthat2-day-olddroneandworkerlarvaewerecloseringeneexpressionprofilesthan2-day-oldqueenlarvae.Thisindicatedthatforyounglarvae(2-day-old)environmentalfactorssuchaslarvaldiethaveagreatereffectongeneexpressionprofilesthanploidyorsexdetermination.Droneshadthemostdistinctgeneexpressionprofilesatthe4-daylarvalstage,suggestingthathaploidy,orsexdramaticallyaffectsthegeneexpressionofhoneybeelarvae.Dronelarvaeshowedfewerdifferencesingeneexpressionprofilesatthe2-dayand4-daytimepointsthantheworkerandqueenlarvalcomparisons(598against1190and1181),suggestingadifferentpatternofgeneexpressionregulationduringthelarvaldevelopmentofhaploidmalescomparedtodiploidfemales.Thisstudyindicatesthatearlyindevelopmentthequeencastehasthemostdistinctgeneexpressionprofile,perhapsreflectingtheveryrapidgrowthandmorphologicalspecializationofthiscastecomparedtoworkersanddrones.Laterindevelopmentthehaploidmaledroneshavethemostdistinctgeneexpressionprofile,perhapsreflectingtheinfluenceofploidyorsexdeterminationongeneexpression.

  • 标签: CASTE differentiation envir on mental factors
  • 简介:茶树是重要的叶用经济作物,但是茶树每年都要开花结实,消耗大量的养分,导致茶树鲜叶产量减少和品质降低。雌蕊缺失茶树资源是天然的不结实茶树品种。采用IlluminaHiSeqTM2500高通量测序技术,对雌蕊缺失茶树花花芽、花蕾、花进行转录组分析。经组装获得237484条Transcripts,取最长Transcripts作为Unigene,有182123条,将获得的Unigene与Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-prot、KEGG、GO等七种数据库进行注释,有22049条Unigene被注释上26种KOG分类,注释到KEGG的Unigene条数为21315,涉及的pathway有130条。此外,发掘出与花器官形态建成的ABCDE模型的功能基因31个,这些注释信息的完成为茶树花器官发育基因及性别决定相关基因的发掘提供了重要依据。

  • 标签: 茶树 雌蕊缺失 转录组 RNA-SEQ 基因注释
  • 简介:[目的]蜡蚧轮枝菌是一种防治植物病原物和害虫的生防菌,弄清其致病的分子基础具有重要的意义。[方法]利用IlluminaHiSeq技术测序蜡蚧轮枝菌的cDNA文库,并进行RNA-Seq序列拼接和功能注释。[结果]共获得1634670条高品质reads,碱基GC含量48.50%。14856条Unigene经组装拼接后,在Nr、Swiss-Prot、COG和KEGG数据库中分别比对得到1467、9379、6518和4188条Unigenes。采用GO分类工具将21403条Unigenes分成24个功能组,主要包含在细胞组成(1369)、分子功能(1679)和生物学过程(1928)3个大类里,在COG数据库注释的基础上,把6518条Unigenes分成38个功能组,通过GO和COG丰度识别分类,聚类的主要是一般功能预测、次生代谢产物的合成、运输和分解代谢以及信号转导机制起作用的独立基因。能与KEGG路径匹配的108条Unigenes中大部分和新陈代谢途径及次生代谢产物的合成有关。[结论]这些结果将有助于找寻蜡蚧轮枝菌的致病因子,从而丰富其致病机理。

  • 标签: 蜡蚧轮枝菌 RNA-SEQ 转录组
  • 简介:摘要RNA-seq技术是一种使用深度测序技术的转录组学分析方法,利用高通量下一代测序技术来调查、表征和量化转录组,可以迅速全面检测某一物种特定组织特定细胞在某一状态下的几乎所有的转录本和基因序列,已广泛应用于基础研究、临床诊断以及药物研发等领域。多项研究证实其测量精度可与微阵列和定量聚合酶链式反应相媲美。RNA-seq技术可以准确检测在糖尿病视网膜病变(DR)的发病机制中发挥重要作用的mRNA和非编码RNA。利用这一技术研究DR的基因调控及分子机制,有助于寻找DR早期诊断和预测预后的生物标志物,全面系统的研究并分析特定生物学过程中的分子作用机制并寻找新的治疗靶点,对DR的基础研究和临床治疗都将具有重要意义。本文从RNA-seq技术的优势、测序平台的选择、文库制备和数据分析3个方面对该技术进行全面系统的阐述,并对该技术在DR中取得的进展进行总结和分析。

  • 标签: RNA-seq 转录组 基因 糖尿病视网膜病变
  • 简介:摘要目的:探讨晚期离焦识别的分子机制。方法:实验研究。将30只7 d龄白来航鸡随机分为负镜组、正镜组和对照组,分别给予雏鸡右眼-10 D/+10 D/0 D透镜诱导,干预时间为6 d。所有动物均在光学干预前后测量屈光度、眼轴和后极部各组织厚度等生物学参数。采用单因素方差分析对数据进行分析。眼球生物学参数测量完毕后分离眼后极部组织,提取RNA,应用RNA-seq技术筛选差异表达基因,并对其进行GO功能注释、KEGG通路分析及PPI网络分析,观察离焦干预对雏鸡后极部各组织转录组的影响。结果:负镜组、正镜组雏鸡的屈光度、眼轴长度以及脉络膜厚度,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);以P<0.05和|log2FC|>1为筛选标准,负镜组与对照组相比,视网膜有203个差异表达基因,脉络膜有757个差异表达基因,巩膜有1 509个差异表达基因;正镜组与对照组相比,视网膜有191个差异表达基因,脉络膜有378个差异表达基因,巩膜有1 918个差异表达基因。与对照组比,负镜组与正镜组的重叠基因除LOC121112941外均表现出相同的差异表达趋势,GO分析通路存在50%以上重合,KEGG分析视网膜水平的重叠通路是花生四烯酸代谢、酪氨酸代谢和视黄醇代谢;脉络膜水平的重叠通路是内质网中的蛋白质加工,精氨酸和脯氨酸代谢和视黄醇代谢;巩膜水平的重叠通路则为细胞粘附分子、ECM-受体相互作用、粘着斑、细胞因子-细胞因子受体相互作用、硫代谢、糖胺聚糖生物合成-硫酸软骨素/硫酸皮肤素、Toll样受体信号通路、TGF-β信号通路和MAPK信号通路。通过PPI蛋白互作网络分析鉴定出离焦识别过程中各组织的关键基因。结论:本研究在转录组水平上筛选出晚期离焦识别过程的绝大多数重叠基因保持着相同的上调或下调表达趋势,不同方向的离焦信号可能诱导部分通路的相似变化。

  • 标签: 正视化 屈光不正 视网膜 脉络膜 巩膜 RNA-seq
  • 简介:目的在验证不同浓度叶酸培养影响人正常肝细胞系增殖、周期和迁移能力的基础上,应用转录组测序(RNASeq)技术筛选差异表达基因,为进一步探讨叶酸缺乏与基因差异表达以及正常肝细胞恶性转化之间的相关性打下基础。方法不同浓度叶酸培养(无叶酸组0mg/L,正常叶酸组40mg/L)的人正常肝细胞系QSG-77016个月,应用CCK-8实验检测细胞增殖、流式细胞技术检测细胞周期、细胞凋亡、Transwell小室检测细胞迁移;利用RNA-Seq技术对两组细胞中的mRNA进行检测,筛选差异mRNA;通过用实时定量PCR对RNA-Seq的结果进行验证,并结合统计学和生物信息学方法分析差异mRNA。结果无叶酸培养显著提高QSG-7701细胞的增殖能力,促进细胞由静止期进入分裂期,促进细胞的迁移能力;RNA-Seq检测得到含有16774条差异mRNA的数据集,初步分析显示其中391条差异mRNA可能与不同浓度叶酸培养相关,其中上调的115条,下调的276条;随机对其中11条进行实时定量PCR验证,72.73%的结果与RNA-Seq一致;分析显示,差异mRNA相对应的基因与细胞周期等生理过程以及多种肿瘤的发生、发展密切相关。结论最终筛选出参与叶酸调控正常肝细胞恶性转化相关的基因,RNA-Seq技术能有效地用于差异基因地筛选。

  • 标签: 叶酸 QSG-7701细胞 转录组测序技术 基因表达
  • 简介:摘要 目的:探究基因组DNA污染及乳腺癌单样本预测器(single sample predictor, SSP)在RNA-seq中鉴定Basal-like亚型乳腺癌的一致性与稳健性。方法:使用4种SSP联合3种数据校正方法,按比例随机去掉一定比例的非Basal-like亚型样本,并使用正态分布模拟基因组DNA对基因表达量的影响。结果:数据校正方法影响乳腺癌SSP鉴定Basal-like亚型的一致性(κ=0.733-0.964);乳腺癌SSP可以一致鉴定出Basal-like亚型(κ=0.846-0.958),对Basal-like亚型鉴定的稳健性高;基因组DNA污染对Basal-like亚型鉴定的一致性影响较小(κ=0.922-1)。结论:Basal-like亚型的鉴定具有高度的一致性与稳健性且受基因组DNA污染影响较小。

  • 标签: 基因组DNA污染 RNA-seq 乳腺癌分型 Basal-like亚型
  • 简介:摘要目的借助全转录组测序(RNA-seq)技术对右眼形觉剥夺模型大鼠视皮层差异表达基因进行筛选和生物学功能分析。方法将18只14日龄SD幼鼠按照随机数字表法随机分为空白对照组和单眼形觉剥夺组,每组9只。其中单眼形觉剥夺组幼鼠采用右眼眼睑缝合方法制作单眼形觉剥夺模型,连续14 d。分别于造模前和造模后14 d记录各组大鼠右眼图形视觉诱发电位P100波的潜伏期和振幅。分别提取各组大鼠双侧视皮质组织,通过RNA-seq技术,筛选出弱视相关发病基因,利用基因本体论(GO)富集分析对上述基因进行生物学功能描述,并进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析。结果与空白对照组相比,单眼形觉剥夺组P100波潜伏期明显延长,振幅明显下降(均P<0.05),表明造模成功。共筛选出左侧视皮质差异表达基因40个,右侧视皮质差异表达基因63个,其中9个基因重叠。GO富集分析表明,差异表达基因主要参与转录DNA模板化、谷氨酸分泌、RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录调控、蛋白磷酸化等生物学过程,参与DNA结合、ATP结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、钙离子结合、锌离子结合、磷脂酶A2活性、核酸绑定等分子功能,参与细胞内、内质网的膜等细胞组分。其中,Grm2、Pla2g2a基因的异常表达可能与视功能损伤改变过程密切相关,Grm2基因主要参与谷氨酸突触、长时程增强(LTP)、长时程抑制(LTD)等视觉信号通路过程,Pla2g2a基因主要参与α-亚麻酸代谢通路和花生四烯酸代谢通路。结论单眼形觉剥夺大鼠视觉发育敏感期内存在双侧视皮质基因的异常表达,导致视觉信号传导功能异常。基于特定响应基因调控的代谢通路改变可能是弱视发病的重要的分子生物学机制之一。

  • 标签: 全转录组测序 大鼠模型 图形视觉诱发电位 形觉剥夺 生物信息学
  • 简介:摘要单细胞RNA测序技术(single cell RNA sequencing, scRNA-seq)从单个细胞水平分析细胞转录组,能够发现细胞中基因突变引起的差异表达。基于胰岛的发育图谱和异质性特征描绘是目前scRNA-seq在糖尿病中的主要应用;还可用于标记和纯化胰岛成体干细胞中功能性β细胞,有望改善1型糖尿病患者β细胞移植成功率;该技术帮助研究糖尿病β细胞去分化和免疫调节,应用于糖尿病治疗。同时,scRNA-seq在糖尿病性视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病动脉粥样硬化和糖尿病周围神经病变中运用已经起步,即将迎来多样化的使用场景和广阔的应用前景。

  • 标签: 单细胞RNA测序 糖尿病 胰岛β细胞 糖尿病并发症
  • 简介:摘要川崎病是一种急性、自限性系统性血管炎,好发于5岁以下儿童,常见并发症为冠状动脉病变。目前认为川崎病的发病机制涉及多种因素,包括遗传易感性、免疫应答紊乱、炎症损伤等。近十年,单细胞RNA测序技术通过解析组织中单个细胞的基因表达谱,可识别新的或罕见的细胞亚群,构建细胞轨迹,广泛应用于心血管疾病研究。该文将回顾单细胞RNA测序技术,对其在川崎病动物模型和急性期川崎病的病理生理机制等研究中的应用进行综述。

  • 标签: 儿童 单细胞RNA测序 川崎病 冠状动脉病变
  • 简介:摘要:通过高通量测序技术对及鸡输卵管细胞外囊泡中的总RNA样品进行测序,并通过生物信息学分析测序结果进行分析,结果共鉴定出265个已知miRNA,并预测出14个新miRNA;此外,针对miRNA预测分析共发现4089个靶基因,其中3801个有效靶基因。经过对表达量降序排序的前50位miRNA靶基因进行GO富集预测发现,细胞外囊泡miRNA靶基因除细胞组分有显著富集点外,分子功能等无显著富集。通过KEGG预测发现目标基因参与多种生化反应,对细胞的生长、发育、分裂等方面具有潜在重要作用。

  • 标签: 鸡输卵管细胞外囊泡 miRNA 测序分析 生物信息学分析。
  • 简介:摘要目的使用RNA测序技术比较原发性开角型青光眼(POAG)与正常人小梁网组织基因表达谱的差异,探讨POAG可能的基因学病因。方法实验组小梁网组织来自汕头国际眼科中心行小梁切除术的3例POAG患者,对照组小梁网组织来自汕头眼库的2例非POAG供体眼球。提取2个组小梁网组织RNA进行测序获得基因表达谱,用R软件包edgeR分析实验组与对照组基因表达的差异,用DAVID生物信息分析网站对差异基因进行基因本体(GO)及功能注释聚类分析。采用KOBAS 3.0进行PANTHER富集通路分析,揭示POAG可能的基因学病因。结果(1)RNA测序共得到28 821条基因,2个组间有统计学差异的基因22条[错误发现率(FDR)<0.05],其中转录表达上升的基因1条,转录表达下降的基因21条;(2)表达差异的基因功能集中,生物学过程涉及角化、表皮发育、中间丝细胞骨架组织等,细胞成分涉及角蛋白丝、中间丝、细胞外泌体、触珠蛋白-血红蛋白复合体等,分子功能涉及结构分子活性、细胞骨架结构组成等;(3)与差异基因相关的PANTHER富集通路主要包括纤溶酶原激活级联反应、p38 MAPK、氧化应激反应及p53通路等。结论角蛋白表达异常、中间丝细胞骨架结构改变、血纤维蛋白溶酶原激活级联反应以及p38 MAPK等通路调控改变引起的小梁网及细胞外基质重塑可能是POAG发病的原因。其中,与发病机制相关的差异基因主要包括细胞骨架相关基因及细胞外基质重塑相关基因,细胞骨架及细胞外基质可作为青光眼治疗的靶组织。

  • 标签: 原发性开角型青光眼 小梁网 RNA测序
  • 简介:摘要目的通过RNA测序(RNA sequencing,RNA-Seq)对先天性马蹄内翻足(congenital talipes equinovarus,CTEV)患儿血浆中游离的总RNA行全转录组测序,比较CTEV患儿与正常儿童血浆的mRNA、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、环状RNA(circular RNA,circRNA)以及微小RNA(microRNA,miRNA)的差异表达,揭示CTEV的可能致病机制。方法选取3例CTEV患儿(试验组)及3例正常儿童(对照组)血浆样品,应用RNA-Seq技术分析3对血浆样品的转录组,筛选出CTEV患儿与正常儿童的差异表达基因与转录本。应用基因本体论方法对差异表达基因进行功能显著性富集分析,基于基因与基因组京都百科全书对差异基因进行显著性信号通路富集分析。结果成功构建样品的基因表达谱:试验组和对照组共有181个差异表达基因,其中58个上调基因,123个下调基因。差异表达lncRNA 23个,上调12个,下调11个。差异表达miRNA 23个,上调11个,下调12个。未筛选出差异表达circRNA。其中分泌磷酸蛋白1(secreted phosphoprotein 1,SPP1)和核糖体蛋白S27(ribosomal protein S27,RPS27)在试验组和对照组中基因表达量差异明显,差异倍数分别是82.24和0.01。结论RNA测序可对CTEV患儿和正常儿童的血浆中差异表达基因进行筛选。SPP1和RPS27可能与CTEV的发病相关。

  • 标签: 儿童 先天性马蹄内翻足 全转录组测序 RNA测序 差异表达基因
  • 简介:摘要目的分析肺腺癌合并肺栓塞患者的差异表达基因,探讨肺腺癌合并肺栓塞可能的发病机制。方法前瞻性研究。采用RNA测序技术检测新疆医科大学附属肿瘤医院2019年1~12月肺腺癌合并肺栓塞患者、肺腺癌患者及肺栓塞患者(每组均4例)外周血中RNA表达,使用生物信息学分析肺腺癌合并肺栓塞组对比肺腺癌组及肺栓塞组的差异表达基因。经Excel软件取交集,筛选两对比组共同差异基因,利用Metascape在线工具对共同差异基因进行基因本体(GO)富集分析及京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析。结果从两对比组差异基因中筛选出147个共同差异基因,其中80个上调差异基因,67个下调差异基因,其中P值最小的前5个共同差异基因分别为:CD177、S100P、HP、EPHA4、PRTN3。GO分析显示共同差异基因主要富集于中性粒细胞活化、轴突发育、白细胞分化、防御反应的负调控等过程,KEGG富集分析显示共同差异基因主要参与代谢途径、肺结核、癌症途径、血小板活化等通路。结论CD177、S100P、HP、EPHA4、PRTN3等基因可能参与肺腺癌合并肺栓塞的发生,中性粒细胞活化、血小板活化等生物学过程及通路也可能与肺腺癌合并肺栓塞相关。

  • 标签: 计算生物学 肺癌合并肺栓塞 差异基因 静脉栓塞 RNA测序
  • 简介:摘要自2016年首次对人类胰岛进行单细胞水平RNA测序后,涌现了大量关于小鼠及人类胰岛的测序分析结果,为胰岛细胞生物学的研究带来了新的进展。研究证明,单细胞RNA测序技术能够表征罕见类型内分泌细胞,观察到典型内分泌细胞的异质性和新的细胞亚型,更好地分析内分泌细胞的种属间差异,以及更精准地描述胰岛各类型细胞在发育和代谢性疾病中的不同状态。目前,单细胞RNA测序技术对低丰度转录本的检测效能尚较低,但随着技术的改善和分析方法的进步,该技术无疑将成为探索胰岛细胞异质性、发育及代谢性疾病生物学特征的重要工具。

  • 标签: 胰岛 细胞生物学 单细胞RNA测序
  • 简介:摘要目的研究血清中微小核糖核酸(miRNA)的特异性表达与儿童扩张型心肌病(DCM)发生的相关性。方法收集2013年11月至2016年3月就诊于北京安贞医院小儿心脏中心且被确诊为DCM的儿童血清(DCM组,16例)及同期于北京安贞医院体检的年龄性别匹配的健康儿童血清(健康对照组,12例),并进行miRNA测序。后期扩大样本量(DCM组扩大为30例,对照组扩大为16例),对测序结果中有统计学意义的11种miRNAs行实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)验证。结果血清miRNA测序结果,DCM组患儿较健康对照组儿童有172个miRNAs上调(fold change>2,P<0.001),未发现下调的miRNAs。选择显著上调的top11miRNAs进行qRT-PCR试验验证,发现DCM组患儿血清中8个miRNAs(let-7f、let-7g、miR142-5p、miR143-3p、miR26a、miR27a-3p、miR27b-3p、miR126-3p)显著上调,差异均有统计学意义(均P<0.05)。在诊断DCM的受试者工作特征(ROC)曲线中,血清miR142-5p、miR143-3p、miR27b-3p、miR126-3p的曲线下面积分别为0.983、0.992、0.915、0.950,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论本研究发现4个血清miRNAs(miR-142-5p、miR-126-3p、miR-143-3p和miR-27b-3p)可用来区分DCM患儿和健康儿童。循环miRNAs可作为有效的儿童DCM筛查工具。

  • 标签: 扩张型心肌病 微小核糖核酸 心力衰竭 儿童
  • 简介:摘要目的阐明高频重复经颅磁刺激(rTMS)对脑梗死大鼠认知功能的影响,通过RNA测序探索其潜在机制。方法选择30只SD雄性大鼠进行短暂性大脑中动脉闭塞(tMCAO)造模,根据Bederson评分排除10只不在1~3分的大鼠,剩余20只模型大鼠用随机数字表法分为tMCAO组(n=10)和rTMS组(n=10),另设假手术组(n=10)。rTMS组大鼠于术后第7~28天接受20 Hz rTMS干预治疗。术后第28~33天进行Morris水迷宫实验检测各组大鼠认知功能,在rTMS组和tMCAO组各取3只大鼠的梗死灶周围皮质组织进行RNA测序。结果rTMS组[(53±4)s]和假手术组[(51±5)s]的逃避潜伏期明显短于tMCAO组[(58±4)s,P<0.05];rTMS组[2.5(1.5~3.0)次]和假手术组[3.0(1.5~3.0)次]大鼠在60 s内穿越原平台的次数多于tMCAO组[1.0(0.5~1.5)次,P<0.05]。RNA测序共发现16个显著差异表达基因,包括9个上调基因和7个下调基因。GO分析结果显示,上调基因的功能主要集中于化学和金属离子稳态等过程,而下调基因的功能则主要集中于炎症反应。结论20 Hz rTMS能够显著改善脑梗死大鼠的认知功能,其机制可能与维持化学和金属离子稳态及调控小胶质细胞的极化减轻神经炎症相关。

  • 标签: 经颅磁刺激 短暂性大脑中动脉闭塞 RNA测序 认知功能
  • 简介:摘要目的筛选血浆外泌体微小核糖核苷酸(microRNA)作为肝细胞癌(HCC)的诊断标志物,并分析候选miRNA在HCC进展中可能发挥的作用。方法2018年10月至2019年2月收集12例于广州市第一人民医院初诊为"HCC"的患者及12例健康志愿者血浆样本,利用超速离心法收集血浆外泌体,经动态光散射法及蛋白质免疫印迹法鉴定后,提取RNA进行测序。通过定量聚合酶链反应(qPCR)验证候选外泌体miRNA差异表达量,使用t检验分析各miRNA表达量差异。通过生物信息学方法预测候选miRNA的靶基因及可能调控的通路,分析其在HCC进展过程中发挥的作用,组间比较采用t检验。结果以差异表达倍数2倍以上(Fold change>2.0或<0.5,且P<0.05)作为标准,分别比较HCC患者术前、术后及健康志愿者血浆外泌体miRNA的差异表达结果,结合两次结果,筛选表达同时上/下调miRNA共12个。其中,表达上调6个(miR-2115-3p、miR-214-3p、miR-511-5p、miR-1299、miR-10a-5p、miR-375-3p),表达下调6个(miR-219a-2-3p、miR-127-3p、miR-9-5p、miR-383-5p、miR-212-5p、miR-1248)。qPCR验证候选miRNA在HCC患者及健康志愿者血浆外泌体中的表达差异,HCC组miR-1248表达低于健康志愿者组(9.046 ΔCt比7.597 ΔCt,t=2.849,P<0.05)。结论血浆外泌体miR-1248有作为HCC的诊断标志物的潜力。血浆外泌体miR-1248可通过调控受体细胞的细胞外基质受体相互作用、介导代谢重编程抑制HCC进展。

  • 标签: 肝细胞癌 外泌体 微小RNA
  • 简介:摘要目的基于单细胞RNA测序探讨小鼠全层皮肤缺损创面中真皮成纤维细胞(dFb)的异质性与生长因子调控网络。方法采用实验研究方法。取5只8周龄雄性健康C57BL/6小鼠(鼠龄、性别、品系下同)正常皮肤组织,另取5只背部全层皮肤缺损小鼠伤后7 d创面组织,用胶原酶D和DNA酶Ⅰ消化组织获得细胞悬液,用10x Genomics平台构建测序文库,用Illumina Novaseq6000测序仪进行单细胞RNA测序。采用R4.1.1软件的Seurat 3.0程序分析获得2种组织细胞的基因表达矩阵,采用按细胞群、细胞来源、标记皮肤中主要细胞基因分类的二维tSNE云图进行可视化展示。根据已有文献报道和CellMarker数据库检索情况,分析2种组织细胞的基因表达矩阵中标志基因表达情况,对各细胞群进行编号和定义。将基因表达矩阵和细胞分群信息导入R4.1.1软件的CellChat 1.1.3程序,分析2种组织中细胞间通信以及创面组织血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)信号通路中的细胞间通信,2种组织中FGF的各亚型与FGF受体(FGFR)各亚型的两两配对(以下简称FGF配受体对)对FGF信号网络的相对贡献,2种组织中相对贡献排名前2的FGF配受体对信号通路中的细胞间通信。取1只健康小鼠正常皮肤组织和1只全层皮肤缺损小鼠伤后7 d创面组织,行多重免疫荧光染色,检测FGF7蛋白的表达与分布及其与二肽基肽酶4(DPP4)、干细胞抗原1(SCA1)、平滑肌肌动蛋白(SMA)和PDGF受体α(PDGFRα)的蛋白共定位表达。结果健康小鼠正常皮肤组织和全层皮肤缺损小鼠伤后7 d创面组织中均包含25个细胞群,但2种组织中各细胞群中细胞数不一致。PDGFRα、血小板内皮细胞黏附分子1、淋巴管内皮透明质酸受体1、受体型蛋白酪氨酸磷酸酶C、角蛋白10和角蛋白79基因在二维tSNE云图上均有各自明确的分布,分别指示特定的细胞群。将25个细胞群按C0~C24编号,分为9个dFb亚群和16个非dFb群,dFb亚群包括C0间质祖细胞、C5脂肪前体细胞、C13具有收缩能力的肌肉细胞相关成纤维细胞等,非dFb群包括C3中性粒细胞、C8 T细胞、C18红细胞等。与健康小鼠正常皮肤组织比较,全层皮肤缺损小鼠伤后7 d创面组织中细胞间通信更多更密集,其中细胞间通信强度排前3位的细胞群为dFb亚群C0、C1、C2,这3个dFb亚群与创面组织中其他细胞群之间均有通信。在全层皮肤缺损小鼠伤后7 d创面组织中,VEGF信号主要由dFb亚群C0发送、脉管相关细胞群C19和C21接收,PDGF信号主要由周细胞C14发送、多个dFb亚群接收,EGF信号主要由角质形成细胞亚群C9和C11发送、dFb亚群C0接收,FGF信号的主要发送者和接收者均为dFb亚群C6。健康小鼠正常皮肤组织和全层皮肤缺损小鼠伤后7 d创面组织FGF信号网络中的FGF配受体对相对贡献,均是FGF7-FGFR1排在首位,排名第2的分别是FGF7-FGFR2、FGF10-FGFR1;与正常皮肤组织比较,创面组织FGF7-FGFR1信号通路中的细胞间通信更多,而FGF7-FGFR2和FGF10-FGFR1信号通路中的细胞间通信稍有减少或无明显变化;创面组织FGF7-FGFR1信号通路中的细胞间通信强于FGF7-FGFR2、FGF10-FGFR1信号通路;在2种组织中,FGF7信号均主要由dFb亚群C0与C1和C2发送、dFb亚群C6和C7接收。与健康小鼠正常皮肤组织比较,全层皮肤缺损小鼠伤后7 d创面组织中FGF7蛋白表达更多;在正常皮肤组织中,FGF7蛋白主要表达于皮肤间质层且在靠近真皮白色脂肪组织附近也有表达;在2种组织中,FGF7蛋白与DPP4、SCA1蛋白共定位表达于皮肤间质层中,与PDGFRα蛋白共定位表达于dFb中,与SMA蛋白无共定位表达,其中创面组织中的共定位表达多于正常皮肤组织。结论小鼠全层皮肤缺损创面愈合过程中的dFb存在高异质性,为多种生长因子潜在的主要分泌或接收细胞群落,与生长因子信号通路之间存在紧密、复杂的联系;FGF7-FGFR1信号通路是创面愈合过程中的主要FGF信号通路,靶向调控多个dFb亚群。

  • 标签: 伤口愈合 皮肤 真皮 成纤维细胞 成纤维细胞生长因子 单细胞RNA测序 生长因子 细胞间通信