简介：摘要目的探究尿路致病性大肠埃希菌TcpC N端泛素连接酶片段抑制巨噬细胞吞噬的信号通路。方法生物信息学软件分析TcpC N端泛素连接酶片段氨基酸序列结构与功能，并预测其功能位点。PCR扩增tcpc N端不同长度片段tcpc-330、tcpc-450和tcpc-510基因并构建其原核表达系统。Ni-NTA亲和层析法纯化目的重组蛋白rTcpC-N110、rTcpC-N150和rTcpC-N170；Detoxi-Gel层析柱去除目的重组蛋白中可能含有的LPS。Western blot和实时荧光定量RT-PCR检测rTcpC-N110、rTcpC-N150、rTcpC-N170和rTcpC-TIR分别孵育巨噬细胞后胞内MyD88蛋白水平和mRNA水平。Western blot检测上述蛋白质孵育巨噬细胞后NF-κB信号通路活化情况。ELISA检测上述蛋白质孵育巨噬细胞后促炎因子水平。结果TcpC N端片段氨基酸序列中第12位半胱氨酸、第104位色氨酸和第106位色氨酸是其泛素连接酶活性的功能位点。所构建的原核表达系统在IPTG诱导下能够有效表达rTcpC-N110、rTcpC-N150和rTcpC-N170，Ni-NTA亲和层析法提纯后均仅见单一蛋白质条带。Detoxi-gel亲和层析柱处理后rTcpC-N110、rTcpC-N150和rTcpC-N170中LPS为阴性。TcpC泛素连接酶片段能够抑制MyD88蛋白水平但不影响其mRNA水平。TcpC泛素连接酶片段显著抑制LPS诱导的NF-κB信号通路p50和p65的磷酸化。TcpC泛素连接酶片段显著抑制LPS诱导的巨噬细胞促炎因子的产生。结论rTcpC-N110、rTcpC-N150和rTcpC-N170具有抑制MyD88蛋白水平和NF-κB信号通路活化功能，与抑制巨噬细胞固有免疫活性密切相关。

简介：摘要目的探究TcpC对尿路致病性大肠埃希菌(uropathogenic Escherichia coli, UPEC)引发小鼠膀胱炎的作用，并初步了解其致病机制。方法从尿道向C57BL/6小鼠膀胱滴注109 CFU分泌TcpC的UPEC CFT073wt或敲除tcpc基因的CFT073Δtcpc，构建膀胱炎模型小鼠。3 d后处死小鼠取膀胱观察大体病理变化。膀胱4%多聚甲醛固定24 h后，包埋、切片、HE染色观察膀胱组织病理改变情况，免疫组化法对组织中TcpC进行定位。采集上述UPEC菌株感染的小鼠尿液，十倍稀释法计数尿液中细菌载量，PCR检测CFT073wt感染组膀胱组织和尿液细菌基因组DNA中是否存在tcpc基因。实时荧光定量PCR和Western blot检测CFT073wt菌株感染巨噬细胞后胞内TcpC mRNA和蛋白质水平。Western blot和ELISA分别检测上述UPEC菌株对巨噬细胞NF-κB活化和促炎因子表达水平的影响，激光共聚焦显微镜和荧光显微镜分别观察上述UPEC菌株感染巨噬细胞后细菌和细胞活力。结果与CFT073Δtcpc组相比，CFT073wt组小鼠膀胱明显肿大，膀胱组织中有大量中性粒细胞浸润和TcpC。CFT073wt组小鼠尿液中的细菌数量显著多于CFT073Δtcpc组；PCR结果显示，膀胱组织和尿液中的细菌均为CFT073wt。在CFT073wt菌株感染巨噬细胞过程中，胞内TcpC的mRNA和蛋白质水平显著升高。CFT073wt促进巨噬细胞NF-κB信号通路IκBα的蛋白质水平并抑制p65的磷酸化水平和促炎因子的产生。TcpC有利于CFT073wt在巨噬细胞内的存活和侵袭。结论TcpC在CFT073wt感染及引发小鼠膀胱炎过程中表达水平显著升高，并通过抑制巨噬细胞NF-κB信号通路的活化和促炎因子的产生提高CFT073wt在巨噬细胞内的存活率，与UPEC致病及逃逸巨噬细胞固有免疫密切相关。