简介：摘要目的探讨咪达唑仑对被剥夺氧和葡萄糖(oxygen-glucose deprivation，OGD)后的N2a/APP695细胞淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)代谢变化的影响及机制。方法将处于对数生长期的N2a/APP695细胞用平衡盐缓冲液冲洗后随机分为空白组、对照组及实验组。空白组未经OGD处理，在正常培养箱内培养；对照组行OGD处理后继续培养复氧；实验组在OGD处理后加入不同浓度(分别为70、100、125、150 ng/ml)的咪达唑仑继续培养复氧。24 h后用AnnexinV-FITC/双染法流式细胞术检测各组细胞凋亡比例；用Western blot方法检测各组细胞的Caspase-3、Aβ1-42、解整合素金属蛋白酶10(adisintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10)、β-淀粉样前体蛋白水解酶1(β-site APP cleavage enzyme-1，BACE1)、早老素1(presenilin 1，PS1)蛋白水平。结果与空白组相比，对照组的细胞凋亡比例、Caspase-3、Aβ1-42、BACE1及PS1水平显著升高(P<0.05)；APP及ADAM10水平无明显变化(P>0.05)。与对照组相比，实验组细胞凋亡比例、Caspase-3、Aβ1-42显著下降(P<0.05)；咪达唑仑70 ng/ml组BACE1显著下降(P<0.05)，而APP、ADAM10及PS1无明显变化(P>0.05)。结论OGD可通过上调BACE1及PS-1导致Aβ1-42表达增加促使细胞凋亡；而咪达唑仑可通过下调BACE1减少Aβ1-42表达进而减少神经细胞凋亡，发挥对OGD损伤后N2a/APP695细胞的保护作用。

简介：摘要目的评价核因子-E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶-1(HO-1)信号通路在右美托咪定减轻小胶质细胞氧糖剥夺-复氧复糖损伤中的作用。方法BV-2小胶质细胞加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，以1.5×104个/ml的密度接种于96孔培养板(200 μl/孔)或以2×105个/ml密度接种于6孔培养板(每孔2 ml)，置于37 ℃、含5%CO2-21%O2-74 %N2的正常培养箱中培养。采用随机数字表法分为5组(n＝30)：正常对照组(C组)、右美托咪定组(D组)、氧糖剥夺/复氧复糖组(OGD/R组)、氧糖剥夺/复氧复糖+右美托咪定组(OGD/R+D组)和氧糖剥夺/复氧复糖+右美托咪定+ML385组(OGD/R+D+ML组)。C组在正常培养箱中继续培养26 h；D组加入终浓度为10 μmol/L的右美托咪定孵育2 h，随后在正常培养箱中培养26 h；OGD/R组、OGD/R+D组、OGD/R+D+ML组更换为无糖DMEM培养基，置于37 ℃、含5%CO2-1%O2-94 %N2的培养箱中培养2 h，然后换为含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，在正常培养箱中培养24 h；OGD/R+D组和OGD/R+D+ML组于氧糖剥夺前2 h时加入终浓度为10 μmol/L的右美托咪定，OGD/R+D+ML组于加入右美托咪定前30 min时，加入终浓度为4 μmol/L的Nrf2抑制剂ML385。采用MTT法检测细胞活力，流式细胞仪检测细胞凋亡率，ELISA检测上清液TNF-α、IL-6和IL-10的浓度，Western blot法检测细胞核Nrf-2、细胞Nrf-2和HO-1表达，RT-PCR法检测细胞HO-1 mRNA表达。结果与C组比较，OGD/R组和OGD/R+D组细胞活力降低，细胞凋亡率和上清液TNF-α、IL-6、IL-10浓度升高，细胞核Nrf2、细胞Nrf-2、HO-1及其mRNA表达上调(P<0.05)，D组上述各指标差异无统计学意义(P>0.05)；与OGD/R组比较，OGD/R+D组细胞活力和上清液IL-10浓度升高，细胞凋亡率和上清液TNF-α、IL-6浓度降低，细胞核Nrf2、细胞Nrf2、HO-1及其mRNA表达上调(P<0.05)，OGD/R+D+ML组上述差异无统计学意义(P>0.05)；与OGD/R+D组比较，OGD/R+D+ML组细胞活力和上清液IL-10浓度降低，细胞凋亡率和上清液TNF-α、IL-6浓度升高，细胞核Nrf-2、细胞Nrf2、HO-1及其mRNA表达下调(P<0.05)。结论右美托咪定减轻小胶质细胞氧糖剥夺-复氧复糖损伤的机制与促进Nrf2/HO-1信号通路激活，抑制炎症反应有关。

简介：摘要目的研究亚低温对小鼠神经母细胞瘤（mouse neuro-blastoma N2a, N2a）细胞氧糖剥夺/复氧（oxygen glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R）损伤时小泛素类修饰蛋白特异性蛋白酶3（small ubiquitin-like modifier proteins specific protease 3, SENP3）表达的影响。方法体外培养小鼠N2a细胞并予以OGD/R处理，建立模拟大脑缺血/再灌注的OGD/R模型以及亚低温模型；将N2a细胞按照随机数字表法分为3组（每组5孔）：假手术组（S组）、OGD/R组和氧糖剥夺/复氧+亚低温组（OGD/R+HT组）。细胞计数试剂盒（cell counting kit-8, CCK-8）法检测OGD/R后N2a细胞活性，乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放率检测OGD/R后N2a细胞毒性，Hoechst33258染色观察N2a细胞凋亡，实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）分析SENP3 mRNA的相对表达量，Western blot法测定SENP3的蛋白水平。结果与S组比较，OGD/R组和OGD/R+HT组细胞存活率下降、LDH释放率升高、凋亡细胞数量增多、SENP3 mRNA的相对表达量和蛋白水平升高（P<0.05）；与ODG/R组比较，OGD/R+HT组细胞存活率升高、LDH释放率降低、凋亡细胞数量减少、SENP3 mRNA的相对表达量和蛋白水平降低（P<0.05）。结论亚低温减轻N2a细胞OGD/R损伤机制与抑制SENP3的表达有关。

简介：摘要目的评价hsa_circ_0008039和miR-484在人神经母细胞瘤(SK-N-SH)细胞氧糖剥夺-复糖复氧(OGD/R)损伤中的作用及其与线粒体分裂蛋白1(Fis1)的关系。方法体外培养SK-N-SH细胞至对数生长期，采用随机数字表法分为5组(n＝25)：对照组(C组)、OGD/R组、hsa_circ_0008039 siRNA组(S组)、hsa_circ_0008039过表达组(E组)和hsa_circ_0008039 siRNA+miR-484抑制剂组(S+I组)。C组细胞在正常条件下培养；S组、E组和S+I组分别转染has_circ_0008039 siRNA、has_circ_0008039过表达载体、has_circ_0008039 siRNA和miR-484抑制剂后，氧糖剥夺12 h复糖复氧24 h制备OGD/R损伤模型。于复糖复氧24 h时采用CCK-8法检测细胞活力和LDH漏出量，采用RT-qPCR法检测hsa_circ_0008039、miR-484和Fis1 mRNA的表达，Western blot法检测Fis1表达；双荧光素酶报告验证hsa_circ_0008039与miR-484的靶向关系。结果与C组比较，其余4组细胞活力降低，LDH漏出量增加，OGD/R组和E组hsa_circ_0008039和Fis1表达上调，miR-484表达下调，S组hsa_circ_0008039和Fis1表达下调，miR-484表达上调，S+I组hsa_circ_0008039和miR-484表达下调，Fis1表达上调(P<0.05)；与OGD/R组比较，E组和S+I组细胞活力降低，LDH漏出量增加，S组细胞活力升高，LDH漏出量减少，E组hsa_circ_0008039和Fis1表达上调，miR-484表达下调，S组hsa_circ_0008039和Fis1表达下调，miR-484表达上调，S+I组hsa_circ_0008039和miR-484表达下调，Fis1表达上调(P<0.05)；与S组比较，S+I组细胞活力降低，LDH漏出量增加，miR-484表达下调，Fis1表达上调(P<0.01)。双荧光素酶报告实验表明：has_circ_0008039靶向结合miR-484。结论hsa_circ_0008039靶向结合miR-484参与了SK-N-SH细胞氧糖剥夺-复糖复氧损伤的过程，与上调Fis1表达有关。

简介：摘要目的探讨M1型小胶质细胞源性外泌体（M1-exo）对氧糖剥夺/复氧后神经元损伤的影响，并研究其作用机制。方法取对数期生长的小鼠小胶质细胞BV2，加入100 μg/L脂多糖（LPS）和20 μg/Lγ-干扰素（IFN-γ）诱导小胶质细胞极化为M1表型，通过蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）、实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）、免疫荧光法鉴定M1型小胶质细胞。收取M1型小胶质细胞的上清液，用ExoQuick-TCTM试剂盒提取M1-exo，通过透射电镜及纳米颗粒粒径分析（NTA）观察外泌体形态，采用Western blotting法检测外泌体标记蛋白白细胞分化抗原（CD9、CD63）的表达。将生长良好的小鼠神经母细胞瘤细胞N2a分为6组：C组细胞常规培养；O组氧糖剥夺3 h后复糖复氧24 h制备N2a细胞氧糖剥夺/复氧损伤模型；E组的N2a细胞氧糖剥夺3 h后复糖复氧并与M1-exo共培养24 h；NC组、M组和I组分别构建阴性对照、过表达和敲低微小RNA-20a-5p（miR-20a-5p）的M1-exo，通过qPCR检测转染是否成功。NC组、M组和I组N2a细胞氧糖剥夺3 h后，与转染后的M1-exo共培养24 h后检测各项指标。采用细胞增殖检测试剂（CCK-8）法检测细胞活力，采用流式细胞术检测细胞凋亡，采用qPCR法检测miR-20a-5p表达。结果与M0型小胶质细胞相比，M1型小胶质细胞特异性标志物CD32和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）荧光强度及其mRNA和蛋白表达均明显升高〔CD32（荧光强度）：36.919±1.541比3.533±0.351，CD32 mRNA（2-ΔΔCt）：4.887±0.031比1.003±0.012，CD32/β-actin：2.663±0.219比1.000±0.028；iNOS（荧光强度）：29.513±1.197比7.933±0.378，iNOS mRNA（2-ΔΔCt）：4.829±0.177比1.000±0.016，iNOS/β-actin：1.991±0.035比1.000±0.045；均P<0.01〕，证明M1型小胶质细胞被成功激活。电镜下可见M1-exo为圆形或卵圆形囊泡状小体，并有明显膜性结构，直径范围约100 nm。Western blotting结果显示，M1-exo表达特异性CD63和CD9蛋白。与C组比较，O组N2a细胞活力明显下降，细胞凋亡率和miR-20a-5p的表达明显升高〔细胞活力（A值）：0.540±0.032比1.001±0.014，细胞凋亡率：（19.857±0.910）%比（13.508±0.460）%，miR-20a-5p（2-ΔΔCt）：5.508±0.291比1.033±0.101，均P<0.01〕。与O组比较，E组N2a细胞活力明显下降，细胞凋亡率和miR-20a-5p表达进一步升高〔细胞活力（A值）：0.412±0.029比0.540±0.032，细胞凋亡率：（31.802±0.647）%比（19.857±0.910）%，miR-20a-5p（2-ΔΔCt）：8.912±0.183比5.508±0.291，均P<0.01〕，说明M1-exo进一步加重了氧糖剥夺/复氧后N2a细胞的损伤。与E组比较，M组N2a细胞活力明显下降，细胞凋亡率和miR-20a-5p表达明显升高〔细胞活力（A值）：0.311±0.028比0.412±0.029，细胞凋亡率：（36.343±0.761）%比（31.802±0.647）%，miR-20a-5p（2-ΔΔCt）：32.348±0.348比8.912±0.183，均P<0.01〕；而I组N2a细胞活力明显升高，细胞凋亡率和miR-20a-5p表达明显下降〔细胞活力（A值）：0.498±0.017比0.412±0.029，细胞凋亡率：（26.437±0.793）%比（31.802±0.647）%，miR-20a-5p（2-ΔΔCt）：6.875±0.219比8.912±0.183，均P<0.01〕。E组与NC组N2a细胞活力、细胞凋亡率和miR-20a-5p的表达比较差异均无统计学意义。结论M1-exo加重氧糖剥夺复氧后神经元的损伤，这一损伤作用可能与其携载的miR-20a-5p有关。

简介：摘要目的评价突触蛋白-Ⅰ(synapsin-Ⅰ)磷酸化在herkinorin减轻新生小鼠神经元氧糖剥夺-复氧复糖损伤中的作用及其与经典型蛋白激酶Cγ(cPKCγ)的关系。方法原代培养新生cPKCγ＋/＋和cPKCγ-/- C57BL/6J小鼠皮层神经元，培养7 d，采用随机数字表法，将2种神经元各分为3组(n＝5)：对照组(C组)、氧糖剥夺-复氧复糖组(OGD/R组)和herkinorin组(H组)。采用氧糖剥夺1 h、复氧复糖24 h的方法制备氧糖剥夺-复氧复糖损伤模型。H组于氧糖剥夺即刻加入herkinorin 10 μmol/L，孵育1 h，氧糖剥夺结束时洗脱。复氧复糖24 h时收集神经元，采用MTT法检测神经元存活率，采用免疫荧光染色法测定神经突起数量及树突长度。采用Western blot法检测神经元synapsin-Ⅰ和磷酸化synapsin-Ⅰ(p-synapsin-Ⅰ)的表达水平。结果与C组比较，OGD/R组和H组cPKCγ＋/＋小鼠和cPKCγ-/-小鼠神经元存活率降低，神经突起数量减少，树突长度缩短，神经元p-synapsin-Ⅰ表达下调(P<0.05)；与OGD/R组比较，H组cPKCγ＋/＋小鼠神经元存活率增加，神经突起数量增多，树突长度增长，神经元p-synapsin-Ⅰ表达上调(P<0.05)，H组cPKCγ-/-小鼠上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。cPKCγ＋/＋小鼠和cPKCγ-/-小鼠3组间神经元synapsin-Ⅰ表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论herkinorin可通过降低cPKCγ膜转位水平，抑制synapsin-Ⅰ磷酸化，减轻新生小鼠皮层神经元氧糖剥夺-复氧复糖损伤。

简介：摘要目的评价miR-20a-5p在M1型小胶质细胞加重氧糖剥夺-复糖复氧(OGD/R)后神经元损伤中的作用及其与线粒体融合蛋白2(MFN2)的关系。方法将生长良好的BV2小胶质细胞(M0型)用脂多糖(100 ng/ml)和干扰素-γ(20 ng/ml)诱导小胶质细胞极化为M1表型，并通过qRT-PCR和免疫荧光法进行鉴定。将生长良好的N2a细胞采用随机数字表法分为6组(n＝6)：对照组(C组)、OGD/R组(OGD/R组)、M0型小胶质细胞共培养组(M0组)、M1型小胶质细胞共培养组(M1组)、转染miR-20a-5p抑制剂组(I组)和阴性对照组(NC组)。C组细胞常规培养；OGD/R组氧糖剥夺3 h，复糖复氧24 h制备N2a细胞氧糖剥夺-复糖复氧损伤模型；M0组氧糖剥夺3 h，复糖复氧时与M0型小胶质细胞共培养24 h；M1组氧糖剥夺3 h后复糖复氧时与M1型小胶质细胞共培养24 h；I组和NC组分别将转染试剂miR-20a-5p抑制剂和阴性对照miRNA转染至M1型小胶质细胞后，将N2a细胞氧糖剥夺3 h，复糖复氧时与转染后的M1型小胶质细胞共培养24 h。采用CCK-8法测定细胞活力，测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出量，采用qRT-PCR法检测miR-20a-5p和MFN2 mRNA的表达，采用Western blot法检测MFN2表达。结果与C组比较，其余5组细胞活力降低，LDH漏出量增加，MFN2及其mRNA表达下调，OGD/R组、M0组和M1组miR-20a-5p表达上调，I组miR-20a-5p表达下调(P<0.05)；OGD/R组与M0组细胞活力、LDH漏出量、miR-20a-5p、MFN2及其mRNA表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。与OGD/R组和M0组比较，M1组细胞活力下降，LDH漏出量增加，MFN2及其mRNA表达下调，miR-20a-5p表达上调(P<0.05)；与M1组比较，I组细胞活力增加，LDH漏出量下降，MFN2及其mRNA表达上调，miR-20a-5p表达下调(P<0.05)。结论M1型小胶质细胞加重N2a细胞OGD/R损伤的机制可能与M1型小胶质细胞miR-20a-5p表达上调抑制N2a细胞MFN2表达有关。

简介：目的研究丙酮酸乙酯(EP)对大鼠脊髓损伤(SCI)后脊髓早期水肿以及体外氧糖剥夺/复氧(OGD/R)损伤所致的大鼠脊髓星形胶质细胞水肿的作用。方法建立成年SD大鼠SCI模型,观察经腹腔注射EP抑制高迁移率族蛋白1(HMGB1)后脊髓水含量、HMGB1表达以及星形胶质细胞活化[胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达]情况。体外培养新生SD大鼠脊髓星形胶质细胞,建立OGD/R模型模拟脊髓损伤后缺血再灌注状态,观察EP对其水肿体积、HMGB1表达、水通道蛋白4(AQP4)表达以及Toll样受体4(TLR4)/核转录因子-κB(NF-κB)通路活化的作用。结果SCI后1d大鼠脊髓水含量较12h、3d明显增加,腹腔注射50mg/kgEP较25mg/kg、100mg/kgEP减轻了SCI后脊髓水肿,降低HMGBI表达与星形胶质细胞活化,体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞OGD6h/R24h时较OGD6h/R6h,OGD6h/R12h细胞水肿体积明显增大,12μmol/LEP较6μmol/LEP能够减轻其水肿体积,降低HMGB1及AQP4表达,减少TLR4/NF-κB通路活化,以上比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论EP抑制HMGB1能够减轻大鼠SCI后脊髓早期水肿以及OGD/R所致的体外培养大鼠脊髓星形胶质细胞水肿和AQP4表达。

简介：目的：比较补阳还五汤含药血清和含药血浆对缺氧培养的大鼠脑微血管内皮细胞（BMECs）分泌NO、vWF、6-ketoPGF1α的水平与体内实验真实值的接近程度,为半体内实验选择含药血浆还是含药血清提供参考依据。方法：以氧剥夺BMECs模型为研究对象,观察补阳还五汤含药血浆和含药血清对BMECs条件培养液中一氧化氮（NO）、血管性假血友病因子（vWF）、6-酮-前列腺素1α（6-keto-PGF1α）含量的影响,并与补阳还五汤干预的中动脉阻塞模型大鼠血浆上述指标水平进行比较。结果：结果发现：与空白血浆组合空白血清组比较,补阳还五汤含药血浆和含药血清均能明显降低氧剥夺BMECs条件培养液中vWF的含量,升高NO、6-keto-PGF1α水平,差异均有统计学意义（P〈0.05或P〈0.01）;含药血浆组vWF、6-keto-PGF1α水平与体内实验的相关系数r分别为0.928和0.933,明显高于含药血清组（r=0.715、0.770,P〈0.05）,而含药血浆组和含药血清组NO含量与体内实验相关系数分别为0.702、0.759,两者差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：运用半体内实验研究补阳还五汤对脑血管内皮细胞的作用,血浆药理学方法比血清药理学方法可靠。

简介：最高人民法院《关于在执行附加刑剥夺政治权利期间犯新罪应如何处理的批复》主张主刑执行完毕后在剥夺政治权利期间又犯新罪的，应当依据先减后并原则数罪并罚。这一规定将《刑法》第71条中的“刑罚”解释为包括主刑和附加刑，混淆了数罪并罚与累犯的界限，导致得出被剥夺政治权利的被告人在主刑执行完毕后在剥夺政治权利期间因犯新罪而重新享有政治权利这一难以令人接受的结论，也导致了司法实践的混乱。针对该《批复》存在的问题，数罪并罚中“刑罚执行完毕”中的“刑罚”应限于主刑，在执行附加刑剥夺政治权利期间犯新罪并不中断前罪剥夺政治权利期间的计算。