简介：水稻P450基因家族成员CYP81A6参与稻瘟病抗性反应,为了深入研究该基因的功能,本研究利用3次克隆的策略构建了该基因的RNAi载体。首先设计带有酶切位点的基因特异性引物,以cDNA为模板扩增3’非翻译区的特异片断,将目的产物连接到T载体上,经菌落PCR和酶切鉴定后进行测序。测序结果表示,目的片断已正确克隆到T载体上。然后利用双酶切通过2次亚克隆将目的片断以反向重复克隆到RNAi载体ds1301,通过分子检测表明,CYP81A6的RNAi载体构建成功,有助于后续的基因功能和作用机理的研究。

简介：桔小实蝇是重要的柑橘害虫,目前已对多种杀虫剂产生不同程度的抗性,化学防治方法往往效果不理想,近年来植物转基因抗虫育种技术表现出巨大的潜力,这为更好地防治桔小实蝇提供了新思路。本研究为获得桔小实蝇抗性转基因柑橘,对桔小实蝇细胞色素P450基因(cytochromeP450monoxygenases,P450)和电压门控钠离子通道基因(sodiumchannel,SC)进行核苷酸序列比对,分别克隆得到片段大小为590bp和550bp的P450基因和SC基因的正反目标片段,利用植物表达载体pFGC5941,将基因正反向片段与Intron两端连接,成功构建RNA干扰(RNAi)载体"pFGC-P1F1R1/P2F2"和"pFGC-C1R1/C2R2"。本研究利用XhoⅠ-NcoⅠ、XbaⅠ-BamHⅠ酶切位点对质粒和载体进行双酶切分析实验,克隆测序得到大小为590bp和550bp的两个酶切片段,经核苷酸序列比对分析,验证其与插入片段一致,说明RNAi载体构建成功。通过农杆菌遗传转化体系,将外源重组载体整合到柑橘基因组中,经除草剂筛选、PCR检测分别得到12株转P450基因阳性苗和9株转钠离子通道基因阳性苗,这为后期柑橘抗桔小实蝇效果评价提供了实验材料。