半枝莲提取物诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡及其对凋亡相关蛋白表达的影响

【摘要】 　　目的探讨半枝莲提取物(Scutellaria barbata D. Don extract, SBE)对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2，Survivin和Caspase-3表达的影响。方法体外培养SMMC-7721细胞，以2.5，5和10 mg·L-1SBE处理48 h，并以2.5 mg·L-1顺铂（DDP）作为阳性对照。用MTT法检测细胞抑制率，流式细胞仪检测细胞凋亡率，二步法免疫组化检测Bcl-2，Survivin和Caspase-3蛋白表达。结果 与正常对照组相比，SBE各浓度组细胞抑制率显著升高（P﹤0.001），细胞凋亡率明显上升（P﹤0.01），Caspase-3蛋白表达显著上升（P<0.01或P<0.05），Bcl-2和Survivin蛋白表达明显下降（P<0.01或P<0.05）。结论 SBE具有诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用，其分子机制可能与上调Caspase-3蛋白表达以及下调Bcl-2和Survivin蛋白表达有关。

【关键词】 半枝莲 SMMC-7721细胞 细胞凋亡 Bcl-2; Survivin Caspase-3

　　Abstract：ObjectiveTo explore the apoptosis-inducing effect of Scutellaria barbata D. Don extract（SBE）and the expression of apoptosis associated proteins Bcl-2, Survivin and Caspase-3 on human liver cancer SMMC-7721 cells. MethodsSMMC-7721 cells were treated with 2.5, 5 and 10 mg·L-1 SBE for 48h, and the cells were treated with 2.5mg·L-1 DDP as positive control. The inhibitory rat was evaluated by MTT assay. The apoptotic rate was determined by flow cytometry. The expression of Bcl-2, Survivin and Caspase-3 proteins were detected by two-step immunohistochemical staining.ResultsCompared with control group, the inhibitory rate was increased obviously(P<0.001), the apoptotic rate was increased markedly(P<0.01), the expression of Caspase-3 protein was increased significantly(P<0.01 or P<0.05), while Bcl-2 and Survivin proteins were decreased markedly (P<0.01 or P<0.05) in SBE groups. ConclusionSBE can induce apoptosis of liver cancer SMMC-7721 cells. The molecular mechanism might be related to up-regulating the expression of Caspase-3 and down-regulating the expression of Bcl-2 and Survivin apoptosis related proteins.

　　Key words：Scutellaria barbata D. Don; SMMC-7721 cells; Apoptosis

　　半枝莲Scutellaria barbata D. Don，SB属于唇形科植物，临床上常用于肝癌、肺癌、胃癌和鼻咽癌等多种癌症防治，但具体的抗癌机制尚不明确。研究发现，半枝莲提取物（SBE）能诱导白血病K562细胞凋亡，其作用机制可能与Caspase3的表达升高和活化有关［1］；SBE可诱导人肝癌QGY-7701细胞凋亡，并能上调Bax和下调Bcl-2的表达［2］；SBE还通过上调凋亡相关基因蛋白Fas表达，促进人肝癌Hep-G2细胞凋亡［3］。本研究观察了SBE诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡作用，并检测凋亡相关蛋白Bcl-2，Survivin 和Caspase-3表达情况，以探讨SB抗肝癌作用及其初步分子机制，为临床应用提供实验依据。

　　1 器材与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞

　　人肝癌细胞株SMMC-7721由中科院上海细胞生物研究所细胞库提供。

　　1.1.2 试剂与仪器

　　胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培养基为GIBCO公司产品，碘化丙啶(PI)为Sigma公司产品，四甲基偶氮唑蓝（MTT）为上海普飞生物技术有限公司产品，鼠抗Bcl-2、Survivin和Caspase-3单克隆抗体为Santa cruz公司产品，PowerVisionTM免疫组化检测试剂盒为北京中杉金桥生物技术公司产品。wellscan K3 酶标仪(芬兰)，BX51型显微镜（OLYMPUS），Facscallbar型流式细胞仪（USA）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 药物提取

　　按文献［4］方法，取SB(购于广西壮族自治区百色市中医医院中药房)干品粗粉50 g，用75%乙醇浸泡3 h，共浸泡3次，温度40℃，合并滤液，旋转蒸发器干燥得SB浸膏，二甲基亚枫（DMSO）溶解浸膏样品配制成浓度为10mg·ml-1提取物药液, 再以细胞培养液稀释成所需浓度供实验用。

　　1.2.2 细胞培养和药物处理

　　肝癌SMMC-7721细胞，以含100 U·ml-1青霉素，100 μg·ml-1链霉素、10% FBS的RPMI 1640培养液，在37℃，5%CO2的培养箱中培养，细胞生长至对数增殖期，更换含0，2.5，5，10 mg·L-1SBE新鲜培养液，用DDP(2.5 mg·L-1)为阳性对照组，药物作用时间均为48 h。

　　1.2.3 细胞抑制实验(MTT法)

　　将对数生长期的SMMC-7721细胞移入96孔培养板中，细胞密度约为1×104个/ ml，每孔加入200 μl细胞悬液，培养24 h。吸弃孔内原培养液，加入含SBE的10%胎牛血清RPMI 1640培养液200 μl，每个药物浓度设4个平行复孔，另设DDP为阳性对照组和空白对照孔。培养到44 h，每孔加入MTT（5 mg·ml-1）20 μl，继续培养4 h后终止培养，小心吸弃孔内上清液，每孔加入DMSO 150 μl，用震荡混合仪震荡10 min。选择492 nm波长酶标仪测定每孔光吸收值（OD值）。实验重复3次。按下公式计算抑制率：抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

　　1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡

　　药物作用后，收集各组细胞约1×106个，1 000 r/min离心5 min，弃去培养液；PBS冲洗2次，加入70%预冷的乙醇固定，4℃，1～24 h；离心弃去固定液，PBS冲洗去乙醇；PBS重悬细胞，400目的筛网过滤1次，离心弃去PBS；加入RNase A(终浓度为60 μg·ml-1)，摇匀，37℃温育30 min，加入PI(终浓度为50 μg·ml-1)，4℃避光30 min；每份标本测定(2～4)×103个细胞，流式细胞仪检测，用MoufitLT软件分析结果。

　　1.2.5 免疫组化法检测基因蛋白表达

　　按照二步法免疫组化检测试剂盒说明书操作：药物处理细胞后，收集细胞，PBS冲洗两次；制成细胞悬液涂片，风干后丙酮固定15 min；3%过氧化氢孵育5 min，以阻断内源性过氧化物酶；滴加一抗（稀释1∶100），室温90 min，PBS冲洗，2 min×3次；滴加IgG抗体-HRP多聚体20-30 min，PBS冲洗，5 min×3次；用DAB溶液显色；蒸馏水冲洗、苏木素衬染、脱水、封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。结果分析：Bcl-2蛋白定位于胞膜或胞浆，Survivin和Caspase-3蛋白定位于胞浆，细胞膜或细胞浆染为棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。利用CMLAS彩色病理图像分析系统进行分析，随机计数低倍镜下6个视野中的阳性细胞数和总细胞总数，求出每组细胞的阳性率。

　　1.2.6 统计方法

　　实验数据采用±s表示，用SPSS11.5统计软件进行统计学处理，参数统计采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 各组SMMC-7721细胞抑制率的比较细胞抑制实验结果显示（表1）， SBE各浓度组的细胞抑制率均显著高于正常对照组（P<0.001）。表1 各组SMMC-7721细胞抑制率的比较（略）

　　2.2 各组SMMC-7721细胞凋亡比较在DNA直方图上（图1），SBE各浓度组和DDP组G1峰前均出现凋亡细胞所特有的亚二倍体峰（sub-G1），即细胞凋亡峰；正常对照组，2.5，5，10 mg/L-1 SBE组和DDP组的细胞凋亡率分别为(1.57±0.68)%，（8.06±1.02）%，（15.45±0.90）%，（24.03±2.23）%和（19.46±1.14）%，SBE各浓度组细胞凋亡率均显著高于正常对照组（P﹤0.01，n=6）。

　　2.3 各组SMMC-7721细胞基因蛋白表达比较

　　与正常对照组比较，SBE各浓度组细胞Bcl-2和Survivin蛋白表达明显下降（P﹤0.01或P﹤0.05），Caspase-3蛋白表达明显上升（P﹤0.01或P﹤0.05）。见表2。表2 各组细胞Bcl-2、Survivin和Capase-3蛋白表达比较(略)

　　3 讨论

　　本实验观察到SBE对SMMC-7721细胞具有明显的抑制增殖和诱导癌细胞凋亡的作用，并呈现一定的剂量依赖性。SB含有黄酮类化合物、生物碱、甾类、鞣质等，而SB乙醇提取物主要是黄酮类化合物［5］。研究发现，植物的某些成分如黄酮类和生物碱等化合物具有明显的抗肿瘤作用，并且这种作用的机制之一是诱导细胞凋亡［6］。由此推测，本实验诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的SB活性成分主要是黄酮类化合物，但其确切的抗癌活性成分尚待进一步研究。

　　Caspase-家族是Fas/Apo-1介导的凋亡信号转导途径的关键效应分子，又是多种凋亡途径共同作用的因子，其蛋白表达水平的高低决定着细胞凋亡程度［7］。本实验结果显示，Caspase-3蛋白表达随着SBE浓度增高而升高，提示SBE可以通过影响Caspase-3蛋白水平的表达，激活细胞凋亡程序，进而诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡。

　　Bcl-2蛋白的功能是阻遏细胞凋亡，多种化疗药物及中药的抗肿瘤活性均与Bcl-2基因表达下调有关［8］。生存素（Survivin）是最近发现的凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis protein, IAP)，是迄今发现最强的凋亡抑制因子［9］。Survivin抗凋亡作用已被研究证实，它不仅通过阻断线粒体细胞色素C释放，与下游凋亡效应因子Caspase-3和Caspase-7结合而对其活性产生直接抑制效应，而且还通过与纺缍体纤维的结合，间接抑制Caspase对纺缍体的水解作用，有利于保护有丝分裂细胞的完整性，从而抑制细胞凋亡［10］。另外，Survivin与细胞周期素依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4, CDK4)形成Survivin- CDK4复合体，释放出P21，而P21能进一步与线粒体Caspase-3结合，抑制其活性，阻止细胞凋亡［11］。本研究结果发现，与正常对照组比较，SBE各浓度组Bcl-2和Survivin蛋白表达明显下降，提示SBE诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡机制可能与下调Bcl-2和Survivin蛋白表达有关。

　　在SBE诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡分子机制中，Caspase-3，Bcl-2和Survivin之间关系如何，其他基因是否参与，尚待深入研究。我们相信SB作为一种传统的抗肿瘤中草药，随着其抗肿瘤活性成分及机制的进一步明确，在肿瘤的预防和治疗中必将展现其广阔的应用前景。

【参考文献】
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　　［3］林敬明, 刘 煜, 罗荣城. 半枝莲提取物抗人肝癌Hep-G2细胞增殖及其机制研究［J］.南方医科大学学报, 2006，26(7):975

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