影响黄芪愈伤组织生长和黄芪黄酮合成的因素

【摘要】 　　目的 研究培养基成分和光照对黄芪愈伤组织生长和黄酮类化合物形成的影响。方法使用不同培养基并改变其中碳源、氮源、磷酸盐、钙盐的浓度，在黑暗和光照条件下进行黄芪愈伤组织培养，分光光度法检测愈伤组织中黄酮类化合物的含量。结果黄芪黄酮积累的最佳条件是（24±1）℃暗培养，培养基为MS基本培养基（附加0.5 mg·L-12,4-D和1.0 mg·L-16-BA），其中含有80 g·L-1蔗糖，NH+∶NO3-为1∶2（氮源总浓度为60mmol·L-1），1.5 mmol·L-1KH2PO4，1.496 mmol·L-1CaCl2。结论 蔗糖作为碳源最有利于黄芪愈伤组织生长和黄芪黄酮的生物合成。混合氮源有利于黄芪黄酮类化合物的合成。

【关键词】 膜荚黄芪； 愈伤组织； 黄芪黄酮； 培养基成分

　　Abstract：Objective：To study the effects of culture components and illumination on callus growth and synthesis of flavonoids of Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.Methods：Adjusted the concentration of carbon, nitrogen, phosphate and calcium in the culture solution, and kept the astragalus callus under dark or illumination, then detected the content of flavonoids by spectrophotometry .Results：The optimum condition of total flavonoids of astragalus accumulation was（24±1）℃ in the dark and the basic medium was Murashige and Skoog (MS)(plus 0.5 mg·L-12,4-D and 1.0 mg·L-16-BA) with 80 g·L-1sucrose, 1.5 mmol·L-1KH2PO4 and 1.496 mmol·L-1CaCl2, the proportion of NH+ and NO3- was 2∶1（nitrogen concentration is 60 mmol·L-1）.Conclusion：Sucrose, selected as source of carbon is more favored for the callus growth and the synthesis of saponins than glucose and maltose are. And mixed nitrate is favored for the synthesis of flavonoids compounds.

　　Key words：Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.； Callus； Total flavonoids of astragalus； Culture base component

　　黄芪是豆科黄芪属植物，全世界约二千多种，而我国分布有 278 种、2 亚种 35 变种 2 变型，南北各省区均产［1］。黄芪的根是重要的中草药，其中膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.和蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongho licus (Bge.) Hsiao是它的法定基原，为正品。研究表明黄酮是黄芪主要的活性成分之一，有广泛的药理作用，如清除自由基［2］、调节免疫、抗病毒、抑制血管内皮单层通透性增加等［3］。由于临床上对黄芪药材的需求量大增，黄芪野生资源破坏严重，产量日趋下降，有的产区种群已濒临灭绝［4］，而黄芪人工栽培存在生活周期长、存活率低、劳动强度大、农药残留超标、品质控制困难和有效成分较低等弊端，因此利用植物组织培养技术进行黄芪次级代谢产物的生产是解决目前供需矛盾的有效途径之一。

　　目前，对黄芪中黄酮类物质的研究主要集中在其药理作用上，对黄芩愈伤组织培养和黄酮类物质次生合成的研究尚少见报道。本文研究不同培养基成分对黄芪愈伤组织生长和黄酮类物质积累的影响，旨在为黄芪规模化生产黄酮类物质提供参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料选用实验室盆栽膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. 的幼嫩叶片为外植体材料。

　　1.2 愈伤组织诱导与培养选取生长良好的黄芪植株，取幼嫩叶片，自来水冲洗干净，75%酒精消毒30 s，再用0.1%HgCl2溶液消毒7 min，然后用无菌水冲洗 4 次，无菌滤纸吸干水分，切成0.5 cm2的小块，接种在诱导培养基（MS/6,7-V+0.5 mg·L-12,4-D+1.0 mg·L-16-BA +3%蔗糖+0.8%琼脂，pH 5.8）上，(24±1) ℃暗培养，大约3 d时叶片边缘开始膨胀，第7天时边缘处长出愈伤组织，30 d后挑选生长良好的愈伤组织，称重后继代培养，30 d后收获称重。

　　1.3 黄芪愈伤组织测试指标

干重增量=最终收获干重－接种干重量

黄芪黄酮产量=干重增量×黄芪黄酮含量

称量鲜重时，从培养容器中取出的黄芪愈伤组织，先用滤纸吸净其表面水分。测定干重时，从培养容器中取出的黄芪愈伤组织置于50 ℃下干燥至恒重。实验重复3次取平均值。

　　1.4 黄芪黄酮含量测定

　　1.4.1 黄芪黄酮的提取［5］

　　准确称取已粉碎的愈伤组织1.500 g，加入20倍量的80%乙醇超声波（频率：40 kHz，功率：500 W）提取100 min，醇提掖挥干试剂得醇提物，将此醇提物用适量水溶解，用醋酸乙酯萃取3次（4∶3∶2）。醋酸乙酯萃取液蒸发至干，30%乙醇充分溶解并定容至10 ml，得黄芪黄酮提取液。

　　1.4.2 黄芪黄酮含量的测定［6］

回归方程建立：精密称取芦丁对照品5.0 mg，置于10 ml容量瓶中，用30％乙醇超声溶解定容。精密吸取0.0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml，置于10 ml容量瓶中，分别加入5％亚硝酸钠溶液0.3 ml，摇匀，放置6 min，加入10％硝酸铝溶液0.3 ml，放置6 min，加入4％氢氧化钠溶液4 ml，加30％乙醇定容。在510 nm 波长处测定吸光度。得回归方程：A=0.008 4C-0.000 8(r2=0.999 3)。

　　黄芪黄酮含量测定：精取黄芪黄酮提取液0.6 ml，置于10 ml量瓶中，按标准曲线项操作。用回归方程计算黄芪黄酮的含量，折算成愈伤组织中的含量和每升培养基的产量。

　　2 结果

　　2.1 不同基础培养基对愈伤组织生长和黄芪黄酮合成的影响

　　由表1可知MS培养基有利于愈伤组织的生长和黄芪黄酮的合成，为最佳基础培养基。表1 不同基础培养基对愈伤组织生长和黄芪黄酮合成的影响（略）

　　2.2 不同碳源对愈伤组织生长和黄芪黄酮合成的影响

　　由表2可知，蔗糖有利于黄芪愈伤组织的生长和黄芪黄酮的合成，为最佳碳源。表2 不同碳源对愈伤组织生长和黄芪黄酮合成的影响（略）

　　2.3 不同蔗糖和葡萄糖浓度对愈伤组织生长和黄芪黄酮合成的影响由图1可以看出随着培养基中的碳源浓度的增加，愈伤组织的干重增量和黄芪黄酮产量都明显增加，但高到100 g·L-1时两者又受到了抑制。以80 g·L-1的蔗糖时愈伤组织增量和黄芪黄酮产量最高。2.4 氮源对愈伤组织生长和黄芪黄酮合成的影响

　　植物愈伤组织培养通常采用一定量的硝酸盐或铵盐作为无机氮源，由表3可知当使用等量硝酸盐和铵盐作为混合无机氮源时愈伤组织的干重增量最大，并且硝酸盐比铵盐含量高一倍可以使黄芪黄酮含量提高，黄芪黄酮产量最高。综合考虑NH+∶NO3-为1∶2，总氮浓度为60 mmol·L-1时为最佳氮源。表3 氮源对愈伤组织生长和黄芪多糖合成的影响（略）

　　2.5 不同浓度磷酸盐对愈伤组织生长和黄芪黄酮合成的影响

　　由图2可知，在KH2PO4小于1.00 mmol·L-1时，黄芪愈伤组织干重增量和黄芪黄酮产量缓慢增加，在1.00～1.50 mmol·L-1时两者明显增大，两者都在KH2PO4浓度为1.50 mmol·L-1时达到最大，并随着浓度增加而明显减小。因此，KH2PO4浓度为1.50 mmol·L-1时为愈伤组织生长和黄芪黄酮合成的最佳浓度。

　　2.6 不同浓度钙盐对愈伤组织生长和黄芪黄酮合成的影响

　　由图3可知，愈伤组织干重增量在CaCl2浓度小于2.99 mmol·L-1时明显增加，在2.99 mmol·L-1时达到最大，大于2.99 mmol·L-1时随浓度增大而减小。黄芪黄酮产量在CaCl2浓度小于1.496 mmol·L-1时明显增加，在1.496 mmol·L-1时达到最大，大于1.496 mmol·L-1时随浓度增大而减小。综合考虑，CaCl2浓度为1.496 mmol·L-1是最佳CaCl2浓度。

　　2.7 添加有机物对愈伤组织生长和黄芪黄铜合成的影响

　　由表4可知，向培养基中添加0.5 g·L-1（培养基）有机物抑制了愈伤组织的生长，对黄芪黄酮含量的影响不大。表4 添加不同有机物对愈伤组织生长和黄芪黄酮合成的影响（略）

　　2.8 光照对愈伤组织生长和黄芪黄酮合成的影响

　　愈伤组织在温度（24±1）℃，光照强度1 500～2 000 lx,光照时间12 h·d-1 的条件下培养，以暗培养的为对照，经培养7 d 后愈伤组织变绿色，约15d 时部分愈伤组织又变回黄色。由表5可知，光照抑制了愈伤组织的生长，也没有促进黄芪黄酮的合成。因此，光照不利于黄芪黄酮的生产。表5 光照对愈伤组织生长和黄芪黄酮合成的影响（略）

　　3 讨论

培养基中盐的种类和浓度对愈伤组织生长和次生代谢有重要影响。首先，碳源是细胞生长的能量来源和调节培养基渗透的重要成分，其种类和浓度对愈伤组织细胞生长和次生代谢产物的合成有不同的效应［7］。本研究表明，黄芪愈伤组织培养中蔗糖是适宜碳源，其中 8％ 蔗糖最有利于愈伤组织生物量积累和黄酮类化合物的生物合成。其次，氮是合成核酸和构成许多酶的主要成分，主要以NH4+和NO3-两种形式被细胞利用。研究表明，氮源的种类和浓度对细胞生长和次生产物合成的影响非常显著［8］。本试验中，当培养基中NH4+和NO3-的比例为1∶2时，促进黄芪愈伤组织中黄芪黄酮的合成。再次，磷是DNA，RNA，ATP等许多生物活性物质的组成元素，对细胞分裂、繁殖、生长和新陈代谢有重要意义。在植物细胞培养中通常由磷酸盐提供细胞所需的磷元素［9］。本研究表明，浓度为1.5 mmol·L-1 的KH2PO4最有利于愈伤组织生长和黄酮类化合物的生物合成。

本文通过研究不同碳源、氮源、磷酸盐和钙盐以及光照对黄芪愈伤组织生长和黄芪黄酮合成的作用，明确了黄芪细胞培养的适宜条件，为进一步开展黄芪细胞悬浮培养和大量培养以便规模化生产黄芪黄酮奠定了基础。

【参考文献】
　　［1］张东佳,杨永建,赵汝能.甘肃黄芪属药用植物资源［J］.中国野生植物资源,2005,24（1）:38.

　　［2］Brigadeau F,Gele P,Marquic C,et a1.Vcntricltlar arrhythmias following exposure of failing hearts to oxidative stress in vitro［J］.Cardiovase Electrophysiol,2005,16(6):629.

　　［3］梁连生，余静.黄芪中黄酮化合物的药理作用［J］.中西医结合心脑血管病杂志,2005,3（12）:1085.

　　［4］赵 明,段金廒,黄文哲,等.中国黄芪属(Astragalus Linn.)药用植物资源现状及分析［J］.中国野生植物资源,2000,19(6):7.

　　［5］李书兰,顾 萱,马丹,等.黄芪中元素铜与有机物含量的相关性研究［J］.中国中药杂志,2006,3l（l5）:1250.

　　［6］鲁建江,王 莉,刘志勇,等.微波技术辅助测定黄芪中总黄酮和多糖的含量［J］.中成药,2003,25(3):246.

　　［7］Smith M A L,Madhavi D L,Fang Y,et a1.Continuous cell culture and product recovery from wild Vacciniumpahalae［J］.J Plant Physiol,1997,150:462.

　　［8］Seung-Heui Kim,Seon-Kyu Kim.Effect of nitrogen source on cell growth and anthocyanin production in callus and cell suspension culture of Sheridan grapes［J］.J Plant Biotech,2002,4(2):83.

　　［9］唐克轩.中草药生物技术［M］.上海:复旦大学出版社,2003:128.