高效液相色谱法测定连贞滴丸中盐酸小檗碱的含量

【摘要】 　　目的建立以高效液相色谱（HPLC）法测定连贞滴丸中盐酸小檗碱含量的方法。方法HPLC色谱条件：C18色谱柱(4.6 mm×200 mm,5 μm)；柱温20℃；流速1.0 ml/min；检测波长345 nm；流动相为乙腈∶0.2%磷酸水（25∶75）。结果盐酸小檗碱的标准曲线为：Y=42 148 043.092 45X-243 222.939 726，r=0.999 1（n=6），峰面积与浓度在0.009 88 ～0.098 8 mg/ml 范围内呈良好的线性关系，平均回收率为100.68%，RSD为1.18%。结论测定方法准确、可靠、可用于控制连贞滴丸的质量。

【关键词】 连贞滴丸 盐酸小檗碱 高效液相色谱法 质量标准

　　Abstract:Objective To establish an HPLC method for determination of the content of berberine hydrochloride in Lianzhen pill．Methods The HPLC conditions were as follows：C18 Column(200 mm×4.6 mm,5 μm),column temperature 20℃,acetonitrice :0.2% sphoric acid water(25∶75) as mobile phase,the flow rate was 1.0 ml/min,and the detection wavelenth was at 345 nm．ResultsThe calibration curve of berberine hydrochloride was: Y=42 148 043.092 45X-243 222.939 726. r=0.999 1（n=6）. The content of berberine hydrochloride showed a good linear relationship in the range of 0.009 88～0.098 8 mg/ml.The average recovery was 100.68%,and RSD was 1.18%.ConclusionThe method is accurate ,reliable,and can be used for quality control of Lianzhen pill .

　　Key words:Lanzhen Pill； Berberine hydrochloride； HPLC； Quality standard

　　连贞滴丸是由黄连、女贞子组成的复方制剂，用于治疗癌症晚期化疗引起的肾衰。为了提高生物利用度，使其方便速效，特研制成滴丸。为确保连贞滴丸的质量，本实验以黄连有效成分盐酸小檗碱的含量为指标，采用高效液相色谱法对其进行含量测定。报道如下。

　　1 试药及仪器

　　1.1 试药

　　黄连，女贞子（购于石家庄乐仁堂，经鉴定符合2005版《中国药典》）；连贞滴丸（自制，批号20070401，20070402，20070403）；盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号110713-200208)；乙腈(色谱纯，天津市康科德科技有限公司，批号051107)；甲醇(色谱纯，德国Fisher Scintific，批号061495)，实验所用其它试剂均为分析纯。

　　1.2 仪器

　　日本岛津高效液相色谱仪SPD-10AVD；检测器(SHIMADZU,SPD-10AVP)；N2010色谱工作站；电热DHG-9070A型鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；分析天平（Sartorius CP225D）；真空泵（DP-01 VACUUM PRESSURE PUMP）。

　　2 方法与结果［1］

　　2.1 色谱条件迪马公司Diamonsil ODSC18柱(4.6 mm×200 mm,5 μm)；流动相为乙腈∶0.2%磷酸水(25∶75)；检测波长345 nm；柱温20℃；流速1.0 ml/min；进样量20 μl。

　　2.2 对照品溶液的制备精密称取105℃烘干5 h的盐酸小檗碱对照品9.88 mg，置100 ml容量瓶中，加盐酸∶甲醇（1∶100）超声处理5 min溶解并定容至刻度，即得（0.098 8 mg/ml）。

　　2.3 供试品溶液制备

　　取连贞滴丸40粒，研细，取适量，精密称定1.479 81 g，置100 ml容量瓶中，加盐酸：甲醇（1∶100）适量，超声处理20 min(25℃)，加盐酸：甲醇（1∶100）至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

　　2.4 阴性对照溶液的制备

　　取缺黄连的连贞滴丸，根据供试品溶液的制备方法，制备阴性对照品溶液。

　　2.5 系统适应性实验精密吸取已制备好的对照品、供试品和阴性样品溶液，照“2.1”项下色谱条件，各进样20 μl，理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算不低于4 838(见图1～4)。结果表明，供试品与对照品溶液均在相同保留时间内出现盐酸小檗碱吸收峰，阴性对照品液在该处无吸收峰，说明本实验条件下盐酸小檗碱峰与其它组分峰分离完全。　2.6 线性关系考察分别精密吸取上述对照品溶液1，2 ，4 ，6 ，8 ，10 ml至10 ml容量瓶中，用盐酸∶甲醇（1∶100）定容。按上述色谱条件进样检测，测定其峰面积值，并以盐酸小檗碱的峰面积Y为纵坐标,对照品中盐酸小檗碱浓度X(mg/ml) 为横坐标进行回归，得标准曲线方程：Y=42 148 043.092 45X－243 222.939 726，r=0.999 1（n=6）。结果表明，在0.009 88～0.098 8 mg/ml范围内，盐酸小檗碱的峰面积与浓度呈良好的线性关系。

　　2.7 精密度实验取滴丸样品，按上述方法制备供试品溶液，连续进样5次，按色谱条件进行检测，以峰面积计算RSD为1.90%(n=5)。结果表明，该方法精密度良好。
　　2.8 稳定性实验取滴丸样品制备供试品溶液，分别于0，4，8，12，16，20，24 h进行测定。其峰面积RSD为2.07%(n=7)。结果表明，供试品溶液24 h内稳定性良好。

　　2.9 加样回收率实验取同一批样品滴丸15粒（约750 mg），按供试品制备方法进行制备，超声处理5 min，定容至100 ml容量瓶中，测定其盐酸小檗碱浓度为0.049 81 mg/ml。精密移取该溶液10 ml置25 ml容量瓶中，平行操作6次，分别加入盐酸小檗碱对照品溶液（0.098 8 mg/ml）4，4，5，5，6，6 ml，超声处理5 min使之混匀，用盐酸∶甲醇（1∶100）定容，依法测定。结果见表1。表1 连贞滴丸加样回收率实验结果（略）

　　2.10 样品含量的测定取3批连贞滴丸(批号20070401，20070402，20070403），依法制成供试品溶液,每批2份，测定滴丸中盐酸小檗碱的含量。结果见表2。表2 连贞滴丸中盐酸小檗碱的含量（略）

　　由实验结果可知，连贞滴丸中盐酸小檗碱平均含量为 6.806 mg/g。

　　3 讨论

　　文献报道以乙腈-0.1%磷酸溶液-十二烷基硫酸钠（45∶55∶0.5）［2］或乙腈-甲醇-0. 03 mo1/L磷酸二氢钾(40∶10∶50 )，每1 000 ml流动相加十二烷基硫酸钠1.0 g，用磷酸调pH值至3. 5 ［3］为盐酸小檗碱流动相，该系统虽然稳定性好，精密度高，不易脱尾，但使用了一定量的磷酸盐，而磷酸盐易溶于水难溶于有机溶剂，在更换流动相时磷酸盐易沉淀下来，而堵塞色谱柱，降低柱效，影响药物成分的分离。经反复实验发现，流动相只用0.2%的磷酸水与乙腈配比也可取得较好的分离效果。但是不同的配比，盐酸小檗碱的保留时间相差很大，例如：乙腈-0.2%磷酸水(24：76)盐酸小檗碱保留时间为25 min，保留时间过长且峰形不美观；乙腈-0.2%磷酸水(28∶72) 盐酸小檗碱保留时间为7 min，保留时间短，样品分离度不好；而乙腈-0.2%磷酸水(25∶75) 盐酸小檗碱保留时间为9～10 min，样品分离好，故本实验以此为流动相。

　　连贞滴丸中以盐酸小檗碱计平均含量为 6.806 mg/g，其平均丸重为0.05 g。考虑到药材来源、生产损耗、储存损耗等因素的影响，按平均值的80%计算，暂定本品每丸盐酸小檗碱含量不小于0.272 mg/丸。

【参考文献】
　　［1］谢秀琼.中药新制剂开发与应用,第2版［M］.北京：人民卫生出版社,2000：316.

　　［2］王志朝,李 强,匡长春.二妙颗粒的制备与质量标准研究［J］.中国药房，2007,18（12）:908.

　　［3］李文连,徐 辉,明晓峰.HPLC法测定黄连上清丸(水丸)盐酸小聚碱含量［J］.中国药品标准，2006,7（1）：21.