四物汤对小鼠血清促红细胞生成素及其基因表达影响的实验研究

【摘要】  　　目的探讨四物汤对环磷酰胺所致贫血小鼠血清促红细胞生成素（EPO）及肾EPO mRNA表达的影响。方法用环磷酰胺腹腔注射建立小鼠贫血模型，同时给小鼠灌服四物汤，ELISA方法检测小鼠血清EPO的含量；Trizol试剂提取肾组织总RNA，反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测肾组织EPO mRNA表达情况（β-actin为内对照标准）。结果四物汤能显著升高小鼠血清EPO水平，明显促进肾组织EPO mRNA的表达。结论四物汤能抑制环磷酰胺所致的小鼠贫血，其作用机制可能是通过促进肾组织EPO mRNA的表达，使肾脏合成EPO增多，从而促进红系细胞生长。

【关键词】  四物汤；促红细胞生成素；基因表达

　　Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of Siwu Tang on erythropoietin(EPO) and EPO mRNA expression of Anemia induced by cyclophamide in mice.MethodsAnemia was induced by cyclophamide in mice,and Siwu Tang were administered.Serum EPO level was measured by ELISA.Total RNA was isolated by Trizol reagent.The mRNA expression of EPO in mouse kidney was measured by RT-PCR(β-actin gene as a control).ResultsSiwu Tang could significantly increase serum EPO level and promote the mRNA expression of EPO in kidney.ConclusionSiwu Tang has inhibitory effects on Cyclophamide-induced anemia in mice and the mechanism may be related to increasing EPO production by promoting the mRNA expression of EPO in kidney,and stimulating the growth of erythroid cells.

　　Key words：Siwu Tang；  Erythropoietin；  Gene expression

    四物汤是祖国医学补血调血的经典方剂，其功用是补血调经，主治血虚兼血滞，疗效显著，但其作用机理尚未完全阐明清楚。本研究用环磷酰胺（cyclophamide ,CY）腹腔注射建立小鼠贫血模型，拟考察四物汤对小鼠血清促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）及肾脏EPO mRNA表达的影响，从分子水平探讨四物汤补血作用的机理。

　　1  材料与仪器

　　1.1  动物昆明种小鼠，6～8周龄，体重20～25 g，雌雄不限，由赣南医学院实验动物中心提供。

　　1.2 四物汤的组成及煎制四物汤由熟地、当归、白芍、川芎组成，购于本院附属医院中药房。按《太平惠民和剂局方》规定的剂量称取，熟地15 g，当归10 g，白芍10 g，川芎6 g，共计41 g/d。按《中药药理研究方法学》［1］计算小鼠的等效剂量为10 g/(kg·d)。传统方法煎制两次，合并后过滤、浓缩，配制成1∶1的药液（即每毫升药液含生药1 g），置4℃保存备用。

　　1.3  仪器及试剂TGL-16G型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；全自动PCR扩增仪（2700型，美国Applied Biosystems公司）；电泳仪（北京六一仪器厂）；紫外分光光度计（2100型，美国Amersham Biosciences公司）；凝胶数字成像系统（法国EEB公司）；环磷酰胺（江苏恒瑞医药公司，批号03041521），Trizol试剂、Oligo(dT)16、Taq DNA聚合酶和dNTP（上海生工）、M-MuLV 反转录酶和50bp DNA Marker（MBI）、EPO检测试剂盒（德国BM公司），其余试剂均为国产分析纯。

　　2  方法

　　2.1  动物模型的建立小鼠常规饲养数天适应环境后，按小鼠体重100 mg/kg于给药第1天用CY腹腔注射1次，造成贫血模型［1］。

　　2.2  动物分组及给药方法30只昆明种小鼠随机分成3组，每组10只，分别为正常对照组（对照组）、CY组、CY+药物组（药物组），灌胃给药。药物组给予四物汤，对照组与CY组给予等体积蒸馏水，连续7d。

　　2.3  血清EPO的测定小鼠眼眶取血，按常规方法分离收集血清，采用ELISA方法测定血清EPO含量（严格按试剂盒说明书操作）。

　　2.4  肾脏总RNA的提取断颈处死小鼠后取肾，取100 mg肾组织用1 ml Trizol试剂提取总RNA（按说明书操作），1％琼脂糖-甲醛变性凝胶电泳及用紫外分光光度计测定OD260/OD280比值鉴定RNA质量。2.5  反转录（RT）取总RNA 1 μg， Oligo(dT)16 0.5 μg在70℃变性5 min后，依次加入5×反转录缓冲液4 μl，10 mM 4 dNTP 2 μl，RNA酶抑制剂20U，混匀后置37℃ 5 min，再加入M-MuLV反转录酶200 U，总反应体积20 μl，混匀后置42℃反应60 min，然后于70℃加热10 min，终止反应。

　　2.6  聚合酶链反应（PCR）小鼠EPO cDNA引物与β-肌动蛋白（β-actin）引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。EPO cDNA引物序列为：5'-CTC TGG GCC TCC CAG TC- 3'和5'-TGT TCG GAG TGG AGC AG- 3'；小鼠特异性的β-actin引物序列为：5'-GTG GGC CGC TCT AGG CAC CA -3'和5'-CGG TTG GCC TTA GGG TTC AGG GGG-3'。EPO cDNA 与β-actin cDNA PCR扩增片段长度分别为410bp与245 bp。PCR反应总体积为50 μl，其中含反转录产物2 μl，EPO cDNA引物各0.08 μmol/L，β-actin引物各0.04 μmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶2.5 U， MgCl2 3.0 mmol/L，10×PCR缓冲液5 μl。PCR扩增条件：94℃预变性2 min，然后94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，循环30次，最后72℃延伸5 min。

　　2.7 凝胶扫描将PCR产物于2.0％的琼脂糖凝胶电泳（50bp DNA Marker作分子量标准），在凝胶成像系统中扫描并分析电泳带的灰度，以特异的EPO cDNA扩增带灰度与同管扩增的β-actin cDNA扩增带灰度之比表示EPO mRNA表达水平。

　　2.8  统计学处理所有资料均以±s表示，组间比较采用t检验，所有数据资料采用统计软件包SPSS11.0完成。

　　3  结果

　　3.1  对小鼠血清EPO的影响注射CY后小鼠血清EPO含量明显升高，CY组与正常对照组比较差异非常显著（P＜0.001）；四物汤能促进EPO的合成，与正常对照组（P＜0.05）和CY组（P＜0.01）比较均有显著性差异。四物汤对血清EPO的影响见表1。表1  四物汤对小鼠血清EPO的影响（略）

　　3.2  四物汤对小鼠肾脏EPO mRNA表达的影响经凝胶成像系统扫描并分析电泳带的灰度，CY组与正常对照组比较，肾脏EPO mRNA表达无显著差异（P＞0.05）；四物汤能促进小鼠肾脏EPO mRNA表达，与正常对照组和CY组比较均有显著差异（P＜0.05）。四物汤对小鼠肾脏EPO mRNA表达的影响见表2。表2  四物汤对小鼠肾脏EPO mRNA表达的影响（略）

　　4  讨论

    在造血过程中，骨髓干细胞首先增殖分化为各系定向祖细胞，包括红系祖细胞（CFU-E）、粒-单核系祖细胞（CFU-GM）、巨核系祖细胞（CFU-MK）和淋巴系祖细胞（CFU-TB），然后逐渐分化成前体细胞（幼稚细胞）和终末血细胞。EPO是一种特异性作用于红系祖细胞的激素糖蛋白，主要在肾脏合成，并通过与促红细胞生成素受体（erythropoietin receptor，EPOR）相结合而发挥作用。缺氧和贫血是刺激EPO合成的主要因素［2］。红系祖细胞（CFU-E）表面存在EPO受体，为EPO反应细胞，EPO与EPOR结合后，激活蛋白激酶，导致反应细胞内蛋白质磷酸化，刺激红系祖细胞不断增殖、分化、成熟，从而促进红系造血。
  
　　抗肿瘤药物环磷酰胺（CY）对骨髓干细胞增殖有明显的抑制作用，是引起肿瘤患者化疗后贫血的主要原因之一。CY以其细胞毒作用抑制细胞分裂，损伤骨髓造血机能，引起血红蛋白减少，包括红细胞在内的多系细胞数量减少。研究表明，四物汤能明显减轻CY对骨髓的抑制、促进骨髓干细胞增殖［3～5］。本实验在注射环磷酰胺后CY组小鼠血清EPO显著升高，与正常对照组比较差异非常显著，而肾脏EPO mRNA表达与正常对照组EPO mRNA表达无显著性差异，说明CY诱发小鼠贫血后血清EPO水平升高与肾脏EPO mRNA表达不呈平行关系。可能的原因是，CY抑制了红系祖细胞的生长，使EPO反应细胞减少，EPOR也相应减少，使EPO不能与EPOR结合，即红系祖细胞对EPO的消耗利用减少，使血清EPO水平增加；而CY引起的贫血对EPO mRNA表达的刺激作用不明显或刺激时间不够长，故CY组EPO mRNA表达无明显增加。药物组EPO mRNA表达明显高于正常对照组与CY组，表明四物汤不但能拮抗CY所引起的骨髓抑制，使骨髓干细胞增殖能力恢复正常，而且具有很强的促进小鼠肾脏EPO mRNA表达的作用，从转录水平使肾脏合成EPO增加并释放入血，从而使血清EPO含量增加。故即使有部分EPO与EPO反应细胞上的EPOR结合，即EPO被消耗利用，药物组小鼠血清EPO仍然明显升高。

   
　　四物汤是经典的中医补血活血方剂，本实验结果表明四物汤能明显增加CY所致贫血小鼠肾脏EPO mRNA的表达，从转录水平使其血清EPO含量增加，是减轻CY毒副作用、增强其疗效的一种有效途径，可用于肿瘤患者化疗后改善贫血状况的辅助治疗。

【参考文献】
  　　［1］陈奇.中药药理研究方法学［M］.北京:人民卫生出版社,1996:1103.

　　［2］朱宪彝.临床内分泌学［M］.天津：天津科学技术出版社，1993:574.

　　［3］王碧英,陈玉春.四物汤补血调血作用机理的研究［J］.深圳中西医结合杂志,2000,10(5):198.

　　［4］马增春,高月,刘永学，等.四物汤对环磷酰胺所致血虚证小鼠造血细胞作用的研究［J］.中国实验方剂学杂志,2001,7(5):13.

　　［5］范启兰,甘祝军,赖日勇，等.四物汤对环磷酰胺所致小鼠贫血的影响［J］.中华实用中西医杂志,2004,4(17),16:2421.