泸州山银花及其提取物高效液相色谱指纹图谱研究

【摘要】  目的建立泸州山银花及其提取物的指纹图谱检测标准。 方法以绿原酸为参照物，采用Lichrosorb C18（10 μm，250 mm×4.6 mm）色谱柱，以甲醇-0.4％磷酸溶液（38∶62）为流动相，流速为0.8 ml·min-1，检测波长为326 nm。结果药材、提取物分别有6个和9个共有峰，共有峰的技术参数和相似度符合国家药品监督管理局颁布的《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》和国家药典委员会颁布的《中药注射剂指纹图谱实验研究技术指南（试行）》的有关规定。结论该方法准确，重复性好，建立的指纹图谱检测标准，可作为山银花及其提取物质量评价与品种鉴别的重要依据。

【关键词】  山银花； 提取物； 高效液相色谱； 指纹图谱

    Abstract:ObjectiveTo establish the fingerprint detecting standard of Flos Lonicerae and its extract. MethodsChlorogenic acid was used as the reference substance. The separation was carried out on a Lichrosorb C18 column（10 μm，250 mm×4.6 mm）with methanol-0.4％ phosphoric acid solution(38∶62) as mobile phase．The flow rate was 0.8 ml·min-1，the detection wavelength was set at 326 nm. ResultsThe medicinal materials and extract respectively had 6 and 9 common peaks，the parameter of which met with the stipulation of Chinese Medicine Injection Fingerprint Technical Requirements and Chinese Medicine Injection Fingerprint Experimental Technical Guides．ConclusionThe method is simple and accurate with a good reproducibility and can be used for quality evaluation and variety discrimination of  Flos Lonicerae and its extract.

    Key words:Flos Lonicerae；  Extract；  HPLC；  Fingerprint

    山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.，红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.或华南忍冬Lonicera confuse DC.的干燥花蕾或带初开的花，具有抗菌消炎、清热解毒、凉散风热的功效，主要用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温热发病等疾病［1］。山银花主要有效成分为绿原酸和异绿原酸。不同来源的山银花，由于受到产地、气候、采收时间及加工方法的影响，致使其有效成分的含量存在着一定的差异，从而影响其临床疗效。四川泸州山银花作为川银花的一个重要来源，其指纹图谱测定尚未见报道。为全面评估本地区山银花及其提取物有效成分的变化及差异，实验采用HPLC法首次建立了泸州四县不同产区采集的山银花及其提取物的指纹图谱，为其质量控制、药材鉴别以及进一步开发利用本地区的山银花提供科学依据。

    1  仪器与试药

    1.1  仪器戴安高效液相色谱仪（P680A四元低压梯度泵，PDA-100二极管阵列检测器，TCC-100柱温箱，Chromeleon色谱工作站）；瑞士Precisa电子天平（XR 205SM-DR）；CQX25-06超声波清洗器（上海必能信超声有限公司，功率250 W，频率25 kHZ）。

    1.2  对照品绿原酸（110753-200412），中国药品生物制品检定所提供。

    1.3  试药甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。

    1.4  样品山银花，10批。分别收购于泸州纳溪、叙永、合江和古蔺（见表1）。经作者鉴定均为灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.的干燥花蕾。山银花提取物，自制。

    表1  山银花样品来源

    样品批号产地采收时间050701泸州市纳溪县2005-07-01050702泸州市纳溪县2005-07-02050801泸州市叙永县2005-08-01050802泸州市叙永县2005-08-02050803泸州市合江县2005-08-03050804泸州市合江县2005-08-04050805泸州市古蔺县2005-08-05050806泸州市古蔺县2005-08-06050807泸州市古蔺县2005-08-07050808泸州市古蔺县2005-08-08

    2  方法与结果

    2.1  色谱条件 色谱柱为Lichrosorb C18（10 μm，250 mm×4.6 mm），流动相为乙腈-0.4％磷酸溶液（38∶62），流速0.8 ml·min-1，柱温35℃，检测波长326 nm。

    2.2  参照物溶液的制备 取经五氧化二磷减压干燥至恒重的绿原酸对照品2.0 mg，精密称定，置50 ml棕色量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每毫升含绿原酸40 μg）。

    2.3  供试品溶液的制备 

    2.3.1  山银花供试品溶液 取山银花适量，50℃烘约5 h，粉碎为细粉（过四号筛）。取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50 ml，称定重量，超声处理45 min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密取续滤液5 ml，置25 ml棕色量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

    2.3.2  山银花提取物供试品溶液 精密称取本品10 mg，加50％甲醇溶液40 ml，超声处理2 min，滤过，用少许50％甲醇溶液洗涤，置50 ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 2.4  方法学考察

    2.4.1  稳定性实验取山银花药材（批号050701）供试品溶液，分别于制备后0，4，8，16，24，36 h检测指纹图谱。以绿原酸峰的保留时间和峰面积为参照，各共有峰的相对保留时间、峰面积比值基本一致，其RSD均小于3％。表明供试品溶液在36 h内稳定，符合指纹图谱的技术要求［2］。

    2.4.2  精密度实验取山银花药材（批号050701）供试品溶液，连续进样5次，检测指纹图谱。各共有峰的相对保留时间、单峰面积占总峰面积≥10％的色谱峰峰面积比值基本一致，其RSD均小于3％。表明精密度良好，符合指纹图谱的技术要求。

    2.4.3  重复性实验取山银花药材（批号050701）样品5份，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，分别检测指纹图谱。以绿原酸峰的保留时间和峰面积为参照，各共有峰的相对保留时间、单峰面积占总峰面积≥10％的色谱峰峰面积比值基本一致，其RSD均小于3％，表明重复性较好，符合指纹图谱的技术要求。

    2.5  山银花药材HPLC指纹图谱的建立

    2.5.1  指纹图谱的建立及共有指纹峰的标定  精密吸取绿原酸参照溶液和山银花供试品溶液10 μl，分别注入液相色谱仪，记录25 min的色谱图，即得。比较不同产地样品的色谱图，其中6个色谱峰是共有的，确定为共有指纹峰见图1。不同批次药材指纹图谱比较见图2。

    图1  山银花药材标准指纹图谱（S-绿原酸）    

    图2  10批山银花药材的指纹图谱

    2.5.2  共有指纹峰技术参数的确定  比较10个批次山银花样品的色谱图，以绿原酸色谱峰作为参照峰（S峰），计算各共有指纹峰的保留时间、相对保留时间、峰面积比值和峰面积比值差值。结果见表2。表2  山银花药材HPLC指纹图谱技术参数

    2.5.3  山银花药材指纹图谱的相似度评价结果  运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”（国家药典委员会）对10批山银花药材的指纹图谱进行相似度分析，以批号为050701的药材的指纹图谱作为参照图谱，以平均数法生成10批药材的对照指纹图谱，10批山银花与对照指纹图谱相似度分别为：0.998，0.996，0.998，0.997，0.998，0.995，0.994，0.996，0.996，0.997。符合国家药典委员会颁布的《中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南（试行）》中的相关规定。

    2.6  山银花提取物HPLC指纹图谱的建立

    2.6.1  指纹图谱的建立及共有指纹峰的标定  精密吸取绿原酸参照溶液和山银花提取物供试品溶液10 μl，分别注入液相色谱仪，记录25 min的色谱图，即得。比较不同产地山银花提取物的色谱图，其中9个色谱峰是共有的，确定为共有指纹峰见图3。不同批次山银花提取物指纹图谱比较见图4。

    图3  山银花提取物标准指纹图谱（S-绿原酸）

    2.6.2  共有指纹峰技术参数的确定  比较10个批次山银花样品的色谱图，以绿原酸色谱峰作为参照峰（S峰），计算各指纹共有峰的保留时间、相对保留时间、峰面积比值和峰面积比值差值。结果见表3。表3   山银花提取物HPLC指纹图谱技术参数

    2.6.3  山银花提取物指纹图谱的相似度评价结果  运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”（国家药典委员会）对10批山银花提取物的指纹图谱进行相似度分析，以批号为060905的提取物的指纹图谱作为参照谱图，以平均数法生成10批提取物的对照指纹图谱，十批山银花提取物与对照指纹图谱相似度分别为：0.997，0.996，0.996，0.996，0.997，0.997，0.996，0.995，0.998，0.997。符合国家药典委员会颁布的《中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南（试行）》中相关规定［3］。

    3  讨论

    在相同的色谱条件下，山银花药材与山银花提取物分别有6个和8个共有峰。从图1、图3可见，山银花提取物除3、4、7号峰外，其余l，S，2，5，6，8号峰分别与药材1，S，2，3，4，5号峰相对应，表明提取物与药材指纹图谱之间具有较好的相关性。但提取物各共有指纹峰与药材对应指纹峰比较，百分峰面积差异较大，这是提取纯化过程受酸碱影响，绿原酸、异绿原酸异构体互为转化而发生量变所致。

    通过实验研究，10批山银花药材及其提取物HPLC指纹图谱相似度较高，均大于0.99，说明泸州市四县所产山银花药材的化学组成一致性较好，质量稳定。该产地的药材作为注射剂的投料药材用，可保证药品质量稳定可控。该方法也可作为该地区山银花药材品质及真伪鉴别的依据。

【参考文献】
  ［1］ 国家药典委员会.中国药典(Ⅰ部)［S］.北京：化学工业出版社，2005：21.

［2］ 国家药品监督管理局. 中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）［J］.中成药，2000，22（10）：671.