rRNA基因内转录间隔区作为遗传标记的应用现状及前景

【摘要】 随着分子生物学技术的不断发展，rRNA基因内转录间隔区（ITS）作为一种遗传标记，已经被广泛应用于微生物菌种分类与鉴定、中药材鉴定和品质评价、植物种质资源鉴定、动物种系发生、遗传多样性与亲缘关系、病原诊断、系统发育研究等不同方面的研究。文章就近年来rRNA基因内转录间隔区的应用现状及前景进行综述。

【关键词】 rRNA基因 内转录间隔区 遗传标记

遗传标记是指可追踪染色体、染色体某一节段或某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性，具有可遗传性和可识别性［1］。生物中任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。rRNA基因又称为rDNA，它是编码rRNA（核糖体RNA）的基因，由rDNA及其相邻的间隔区组成。在真核生物中，rRNA基因内转录间隔区是rDNA上的一个非编码区域，它包括ITS-1（位于18SrDNA和5.8SrDNA之间）和ITS-2（位于5.8SrDNA和28SrDNA之间）区。该区域受外界环境的影响较小，与编码区相比具有进化速度快的特点［2，3］。而原核生物的ITS序列是16S-23SrDNA内转录间隔序列，它在原核生物中普遍存在，在环境条件改变时相对稳定［3］。高等植物中的rDNA是高度重复的串联序列单位，它的ITS序列是18SrDNA-5.8SrDNA-26SrDNA间隔区序列，所受的选择压力小，进化速率较快，在物种间表现出较高的差异。因此，真核生物细胞基因组中rDNA间隔区（18SrDNA-5.8SrDNA-26SrDNA）序列可以作为一种遗传标记。近年来，rDNA ITS已成为重要的分子标记之一，在微生物、动物、植物等各个方面有着广泛的应用。

1 rRNA基因内转录间隔区在微生物菌种分类及鉴定中的应用

原核生物细胞16S-23S rDNA间隔区具有普遍性和高变性，由于不同菌种16S-23S rDNA间隔区所含tRNA的数目、类型不同，具有长度和序列上的多态性，用于菌种分类鉴定具有优越性。因此，可作为菌种分类及鉴定的一种新方法。张灵霞等［4］分别用通用引物a和结核分枝杆菌特异引物b扩增分枝杆菌复合菌群的16S-23SrDNA间隔区序列，扩增产物经RFLP分析，结果显示应用引物a能将除结核分枝杆菌复合菌群外的其它受试菌群中的各菌群分开，而引物b可将结核分枝杆菌与结核分枝杆菌复合菌群中的其它菌分开，从而达到菌种鉴定的目的，为结核病的早期诊断和鉴别诊断提供依据。温博贵等［5］研究发现，rRNA基因间隔区扩增后测序是一种精确、重复性好的鉴定牙龈卟啉菌的分子遗传学方法。LI 等［6］对产氢菌的16S-23SrDNA间隔区进行PCR扩增，发现该间隔区碱基序列存在长度多态现象，利用这一现象可辨认和识别产氢发酵细菌。

传统的真菌分类主要从菌株的形态特征、生长特性、生理生化指标等方面进行，ITS序列标记的出现使得真菌分类鉴定研究提高到一个新的水平。真菌的ITS多态性大都表现为属内种间差异明显，而种内较为一致的规律性。杨红等［7］对尖孢镰刀菌异核体及其同核型分离子菌株的ITS区进行测序分析，结果表明其碱基组成完全相同，属内种间的同源性在34%～99%之间，种内同源性在98%以上。ITS区不适合尖孢镰刀菌种内或种以下水平的分类鉴定。张传博等［8］用rDNA ITS区的PCR-RFLP 技术对9个植物病原真菌与灭蚊真菌进行了快速成功地鉴别，证明了所分离的植物病原真菌主要是瓜果腐霉，与灭蚊腐霉有明显区别。Glushakova等［9］对11个植物种酵母分离株进行鉴定，根据其生理特性和5.8S-ITS rDNA限制性酶切片断将其鉴定为奇异酵母。王桂文等［10］用真菌通用引物对18个红菇子实体样本及3个组织分离株的rRNA基因内转录间隔区进行PCR扩增，以鉴别红菇组织分离株的真伪。结果发现分离株的ITS序列全长明显小于实体样本的ITS序列全长，与红菇属真菌的遗传距离大，均不是红菇的分离株。

骆志成等［11］在国内首次对烟曲霉rRNA基因内转录间隔区进行克隆测序分析，结果显示，烟曲霉rRNA基因的ITSⅠ、Ⅱ区均十分保守。与黄曲霉、黑曲霉、土曲霉等比较，均有一定程度的差异，这说明其种间ITS区序列变异大于种内变异。王强等［12］对16株皮肤癣菌ITS序列进行分析，11株菌与形态学结果一致，1株鉴定为金孢子菌，另外4株不能确定。此结果说明ITS序列分析法可用于菌种鉴定，但有局限性，应与形态学鉴定相互补充。窦红涛［13］将rDNA ITS序列分析用于快速鉴定临床常见的镰刀菌。由此可见，rRNA基因ITS序列分析在临床疾病的诊断和鉴别诊断中应用广泛。

2 rRNA基因内转录间隔区应用于植物类中药材鉴定和品质评价

由于近年来毁林、毁草开荒，自然生态被严重破坏，野生中药材日渐稀少，而人工栽培的中药资源越来越多。在中药材市场上，以次充好、以假乱真的现象严重。因此，如何对中药材进行有效地鉴定和品质评价成为首要待解决的问题。中药材鉴别所依据的遗传标记已从传统的形态标记、生化标记（包括免疫学标记）、组织细胞标记发展到了分子标记，rRNA基因内转录间隔区序列分析技术已越来越多地应用于植物性中药材的品质鉴定中。徐红等［14］通过对14个黄草石斛类群和1个混淆品石仙桃的rDNA ITS序列分析表明，ITS1和ITS2序列信息位点丰富，不同种的石斛各类群均有多个特异性的核苷酸变异位点，与外类群的变异最大，可用于鉴定每一种石斛药材及其混淆品；石斛种间各类群碱基差异百分率高，但显著低于与混淆品间的差异百分率，说明这两段序列在种内保守、种间分化活跃，属间差异较大，可作为中药黄草石斛的分子鉴定标记。王淑美等［15］用特异性PCR技术对16个牛膝样品的rDNA ITS区碱基序列进行扩增测序，结果表明，ITS-1约为230bp，ITS-2约为209bp。牛膝与川牛膝、土牛膝的碱基序列有明显差异，可用于牛膝种间及真伪品的鉴别。沈洁等［16］对7个不同居群的花椒及3个混淆种的rDNA ITS区进行碱基测序发现，花椒与其混淆种的ITS区序列差异非常显著，有71个变异位点，4个特异性识别位点。在花椒各居群中则有15个变异位点、12个信息位点、3个特异性识别位点。依据这个特征可准确鉴别各居群的花椒及其混淆品。丁平［17］、刘忠权等［18］将 rDNA-ITS序列分析分别用于巴戟天及其常见混伪品、白花蛇舌草与其混淆品的鉴定中亦行之有效。

rRNA基因内转录间隔区不仅用于鉴定植物性中药材与其混淆品，还可用于中药材与其近缘种以及道地药材的鉴别。曾明等［19］对中药葛根及其近缘种的rDNA-ITS进行序列分析，结果显示，ITS区序列在种内的差异很小，野葛与粉葛在ITS1、ITS2区的差异性分别在2.10%和2.09%以内，而山葛与野葛、粉葛的差异性则在8.14%和12.82%以上，表明rDNA-ITS序列是鉴别近缘种的理想分子指标。高小霞等［20］研究表明，利用rDNA ITS-RFLP法可快速区分佛手及其近缘种香橼。余永邦等［21］对14个产区的太子参进行ITS扩增及测序，其中4个产区的ITS碱基序列完全一致，另外10个产区的ITS序列有不同的变异，可用于鉴别不同产区的太子参。王东等［22］分析发现怀山药与其它产地山药的rDNA-ITS区序列有着不同的变异，可把地道产区的山药（怀山药）ITS序列作为标准，用以鉴别不同产地的山药。Wang等［23］对不同来源的忍冬进行PCR-RFLP分析，扩增产物中道地忍冬超过70%，而非道地忍冬不足20%。此方法可用于鉴定道地忍冬。

3 rRNA基因内转录间隔区应用于物种亲缘关系及系统发育关系研究

rRNA基因内转录间隔区在不同物种亲缘关系及系统发育关系方面的研究应用广泛。卢明锋等［24］采用真菌通用引物克隆了一株产苝醌衍生物真菌的rDNA-ITS区段，经序列比对表明该菌株与竹黄属的亲缘关系较近，ITS序列相似度达到92%。王晓英等［25］对4株ATCC典型菌株和12株中国不同省区产毒串珠镰刀菌rDNA 间区进行序列测定分析，结果显示，中国rDNA ITS2序列Ⅰ型的串珠镰刀菌与南非分离菌株ATCC 52539一致。中国胶孢镰刀菌分离株SD197-Fmv047和SD207-Fmv049的序列与尖孢镰刀菌高度同源。此结果有助于进一步研究水稻枯萎病赤霉群的系统发育关系。

王超等［26］测定了山羊草属二倍体物种核rDNA-ITS区序列，对其进行聚类分析结果显示，Ae.speltoides与该组其他种相距很远，可从Sitopsis组中独立出来；Ae.uniaristata与不同组的Ae.caudata和Ae.umbellulata关系很近。Stranczinger等［27］对茜草科进行种系发育关系研究，分析了其rDNA-ITS序列，16个种分为3大分支。

喻达辉等［28］利用rDNA-ITS序列对珠母贝属常见种类的系统发育和分类地位进行了分析，所研究的种类聚合成3个大类群。类群I中, 我国的P.fucata，日本的P.fucata martensii和澳大利亚的P.imbricata可能为同种,类群II中P.albina和P.nigra可能是两个亚种。

rRNA基因内转录间隔区除了上述3个主要方面的应用，还能应用于其他方面。郭琼霞等［29］通过对假高粱及其同属近似种的rDNA-ITS区进行扩增和RFLP分析，可将假高粱与明福1号、拟高粱区分开来。王国芬等［30］研究证实斐济球腔菌是目前引起海南省香蕉叶斑病的主要病原菌，并设计了专门检测鉴定该菌的特异性引物，用于香蕉褐缘灰斑病的分子鉴定及辅助检测。 4 rRNA基因内转录间隔区作为遗传标记的应用前景

rRNA基因内转录间隔区作为一种遗传分子标记，与形态标记、细胞学标记和生化标记相比，具有明显的优越性。具体表现为：①该区域受外界环境影响较小，所受选择压力小，进化速度快，在物种间表现出极为广泛的序列多态性；②rDNA-ITS核苷酸序列长度适中，含足够量的遗传信息；③rDNA的ITS区在核基因组内是中等重复的，并且这种重复序列高度相似或一致化，为PCR产物直接测序提供了可能；④能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行扩增比较；⑤此技术快速、灵敏、准确。这些优点奠定了rRNA基因内转录间隔区具有广泛应用性的基础。rRNA基因内转录间隔区在菌种分类鉴定、植物性中药材鉴定、物种亲缘关系及系统发育关系研究、动物种系发生、植物种质资源鉴定等方面的应用已取得重要成果。相信随着现代分子生物学技术日新月异地发展，rRNA基因内转录间隔区将具有更为广阔的应用前景。

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