金线莲挥发油抗人肺癌细胞NCI-H446作用研究

金线莲挥发油抗人肺癌细胞NCI-H446作用研究

林秀钦1杨菁2陈新峰2

林秀钦1杨菁2陈新峰2

（1福清市医院药剂科福建福清350300）

（2福建医科大学附属协和医院药学部福建福州350001）

【摘要】目的探讨福建组培金线莲挥发油对人肺癌细胞NCI-H446增殖能力的影响。方法应用水蒸气蒸馏法提取金线莲挥发油成分，应用透射电镜和DNA-Ladder法检测人肺癌细胞NCI-H446凋亡。结果金线莲挥发油对人肺癌细胞NCI-H446的增殖具有显著的抑制作用，DNA-Ladder可见明显的DNA-Ladder梯形条带。透射电镜可见细胞质出现明显浓缩，胞质内微绒毛减少，基质逐渐消失，内质网结构出现疏松并与细胞膜融合，并可见凋亡小体。结论金线莲挥发油可抑制人肺癌细胞NCI-H446的生长。

【关键词】金线莲挥发油NCI-H446细胞

【中图分类号】R73-3【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）27-0033-02

金线莲别名金线兰、金丝草，为兰科开唇植物花叶兰属多年生珍稀中草药。金线莲具有消炎、抗癌、抑制胆固醇合成酶活性等多种药理作用，因此被广泛运用于医药、食品、化妆品等行业[1]。目前，对金线莲的研究内容大多集中在分布状况、生物学特性调查、文献考证、商品调查、成分分析及组培、栽培等方面，对其抗肿瘤作用的研究报道较少。本课题组前期实验中已提取出金线莲的挥发油成分，并采用GC-MS法对其成分进行鉴定，共分离出78个峰，确定了其中70种化合物[2]。为探讨金线莲挥发油的抗肿瘤作用及其作用机制，本文研究了金线莲挥发油对NCI-H446细胞的增殖影响，现报道如下：

1.材料

福建组培金线莲鲜草购自福建医科大学附属协和医院中药房；NCI-H446细胞（由福建医科大学附属协和医院血研所提供）；CO2培养箱（美国ThermoForma公司）。DNA-ladder试剂盒购自碧云天公司。

2.方法

2.1金线莲挥发油的提取

将新鲜的金线莲用剪刀剪成约0.5cm长小段，精密称取50g，加适量水溶解，浸泡24h，用挥发油提取器提取15h，合并提取液，加入10ml乙醚静置过夜，去乙醚层。得到黄色的挥发油，无水硫酸钠干燥，-20℃保存备用，得油率为0.06%。临用前用DMSO助溶，超纯水稀释。

2.2透射电镜观察NCI-H446细胞形态

取对数生长期的NCI-H446肺癌细胞，接种于6孔板中。次日加80ug/ml的金线莲挥发油及相应溶剂对照的新鲜培养基，24h后，离心收集正常培养和金线莲挥发油处理组的NCI-H446细胞（约1×106个），加1mL预冷的PBS，混匀，移至EP管。4℃，1000r/min，10min，弃上清，加1mLPBS，4℃，1000r/min，10min再洗一次。前固定：加数滴3%戊二醛-1.5%多聚甲醛溶液4℃固定数天；0.1mol/LPBS（pH7.2）漂洗3次。后固定：用1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾4℃固定1.5h；0.1mol/LPBS（pH7.2）漂洗3次。70%酒精饱和醋酸铀染液块染，酒精-丙酮梯度脱水，环氧树脂618包埋剂包埋。超薄切片，厚度80nm。用醋酸铀及柠檬酸铅各染色5min，飞利浦EM208型透射电镜下观察、摄影[21～22]。

2.3DNA-琼脂糖凝胶电泳分析检测NCI-H446细胞凋亡

常规培养NCI-H446细胞，细胞经不同浓度（80μg/mL、160μg/mL）金线莲挥发油处理24h后，收集对照组和给药组的细胞，调整细胞数量为5×106个.ml-,按照DNA-ladder试剂盒要求提取DNA。取5ulDNA进行1.5%琼脂糖凝胶电泳（40V、120min）,用凝胶成像系统观察、摄影。

3.结果

3.1透射电镜观察NCI-H446细胞形态

透射电镜下可见，对照组细胞体积较大呈圆形，形态完整，核圆形或椭圆形，核浆比例大，核内染色质自然分布且疏松细致。金线莲挥发油组细胞胞体变圆且形状不规则，形态不完整，细胞电子密度升高，胞浆浓缩，显示细胞有破裂，胞核染色质分布不均呈致密浓染的块状，聚集在核膜的周边，出现颗粒状、环状或新月状的凋亡小体。

AB

图2透射电镜观察NCI-H446细胞形态(5000×)

A：对照组B金线莲挥发油80μg/mL

Fig.2ObserveNCI-H446withtransmissionelectronmicroscope(5000×)

A:ControlgroupB:80μg/mLA.roxburghiiextracttreatedgroup

3.2DNA琼脂糖凝胶电泳分析检测细胞凋亡

DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示NCI-H446细胞经80ug.ml-和160ugml-的金线莲挥发油处理24小时后，出现明显的DNA阶梯状条带，且160ug.ml-组阶梯状条带及拖带较80ug.ml-组明显，对照组未见阶梯状条带。

图3DNA琼脂糖凝胶电泳法观察细胞凋亡

（1、对照组2:80μg/mL3:120μg/mLM:1200bpmarker）

Fig.2-4ElectrophoresisanalysisofDNAinNCI-H446cells

1:controlgroup;2:80μg/mL;3:120μg/mL;M:1200bpmarker

4.讨论

金线莲具有滋阴润肺、祛风利湿、清热解毒、抗病毒、抗衰老、降血压、平肝等多种功效，在民间享有“药王”之称[3]。在我国的福建、台湾民间及东南亚等地常被用于抗肿瘤的治疗。但对金线莲挥发油成分药理作用的报道较少。

本课题组前期采用水蒸汽蒸馏法提取出金线莲的挥发油成分，采用GC-MS法鉴定出其成分以十六羧酸甲酯（47.98%）、棕榈酸（20.57%）为主，其次为亚油酸（6.17%）、亚麻酸甲酯（4.07%）和2-十二酮（3.73%）[2]。本文对金线莲挥发油的抗肺癌作用进行了研究。

本研究将NCI-H446细胞经金线莲挥发油处理后，提取细胞DNA进行琼脂糖凝胶电泳，发现药物处理后的NCI-H446细胞发生了明显的凋亡，检测到典型的DNA梯状条带，随着金线莲挥发油浓度的增加，所形成的DNA梯形条带越亮透射电镜观察到，经80μg/mL金线莲挥发油处理24小时后的NCI-H446细胞呈凋亡形态改变，出现细胞胞体变圆且形状不规则，形态不完整，细胞电子密度升高，胞浆浓缩，胞核染色质分布不均呈致密浓染的块状，位于核周边；出现颗粒状、环状或新月状的凋亡小体。上述结果提示金线莲挥发油可诱导NCI-H446细胞凋亡,并且随着药物浓度增加，细胞凋亡程度增大。

综上所述，金线莲挥发油具有体外抗人肺癌细胞NCI-H446的作用。本次实验可以为金线莲挥发油的抗肿瘤活性提供初步研究资料，对于金线莲挥发油中的体内抗肺癌作用有待进一步深入研究。

参考文献

[1]顾慧芬，庄意丽，梅其春.野生与组培金线莲有效成分的比较及RAPD分[J],中成药,2011,33(8):1364-1367.

[2]陈焰，陈新峰，杨菁.金线莲挥发油成分的提取及其体外抗肿瘤作用研究[J]，中国药业，2012,21（6）:21-22.

[3]曾庆华,吕新生,汤辉焕.MTT测定恶性肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[J].中国普通外科杂志,2000,9(6):552-554.