实验性糖尿病大鼠心肌组织CaSR蛋白表达的变化*

实验性糖尿病大鼠心肌组织CaSR蛋白表达的变化*

白淑芝1△，吴昊2，姜哓姝1，吴昱3

本文联系人：白淑芝，

电话:19917625808

Email：baishuzhi12@163.com

（1．哈尔滨医科大学病理生理学教研室，2．黑龙江省森工总医院，3．哈尔滨医科大学附属第二临床医院，黑龙江哈尔滨150001）

[摘要]目的：观察钙敏感受体（CaSR）在糖尿病大鼠心肌组织中的表达变化。方法：30只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、糖尿病4周组和糖尿病8周组。高糖高脂饮食4周后腹腔注射STZ（30mg/kg）建立糖尿病模型。通过Westernblot检测心肌组织CaSR和SERCA蛋白的表达。结果：与对照组相比，随着病程的延长糖尿病组大鼠心肌CaSR、SERCA蛋白表达降低。结论：在糖尿病大鼠心肌组织中CaSR的表达降低，并可能导致钙稳态紊乱参与糖尿病心肌病的发生。

[关键词]钙敏感受体；糖尿病；大鼠

*【基金项目】黑龙江省教育厅科技研究项目资助（12541276）

△【通讯作者】Tel：0451–86674548；E-mail：baishuzhi12@163.com

Expressionofcalcium-sensingreceptorofmyocardiumindiabeticrats

BAIShu-zhi1△，WUHao2，JIANGXiao-shu1，WUYu3

（1.DepartmentofPathophysiology,HarbinMedicalUniversity;2.HeilongjiangProvincialForestryGeneralHospital;3.TheSecondAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,HeilongjiangHarbin150001）

【ABSTRACT】Objective:Toobservetheexpressionofcalcium-sensingreceptor(CaSR)ofmyocardiumintype2diabeticrats.Methods:Wistarratswererandomlypidedinto3groupsincludingcontrol,diabetic-4weekanddiabetic-8weekgroups.Ratsinthediabetesgroupwerefedahigh-glucoseandhigh-fatdiet,andintraperitonealinjectionofstreptozotocin(STZ,30mg/kg)wasconducted4weekslatertoestablishatype2diabetesmodel.CaSRandSERCAproteinexpressionsincardiactissueweredetectedbyWesternblot.Results:Comparedwiththecontrolgroup,themyocardiumofdiabeticratsshoweddecreasedexpressionofCaSRandSERCAprotein,andgraduallyworsenedwiththeprolongationofthecourseofthedisease.Conclusion:TheexpressionofCaSRproteininmyocardiumofdiabeticratswasdecreased,whichcancauseintracellularcalciumdisorderandleadtodiabeticmyocardiopathy.

【KEYWORDS】calcium-sensingreceptor；diabetes；rat

糖尿病的发病率逐渐增高，且呈年轻化趋势。累及到心脏可发生糖尿病心肌病（diabeticcardiomyopathy，DCM），造成心功能不全，甚至心力衰竭[1]，其发病机制复杂，迄今尚未完全阐明。钙敏感受体（CaSR）属于G蛋白耦联受体，国内对其研究主要集中在慢性肾衰和甲状旁腺等疾病上，在心血管系统研究的较少[2]。本实验旨在观察实验性糖尿病大鼠不同时间点心肌组织CaSR蛋白表达的变化规律，拟进一步揭示DCM的发生机制。

1材料与方法

1.1实验动物

健康Wistar雄性大鼠(180-250g)，由哈尔滨医科大学附属二院动物研究所提供。

1.2主要试剂和器材

AP（北京索莱宝）、AA、TEMED、分离胶浓缩液、浓缩胶浓缩液、电泳缓冲液、转移缓冲液（北京普利莱）；蛋白定量试剂盒（北京碧云天）；CaSR抗体(AlphaDiagnosticInternationalInc.,USA);SERCA、GAPDH多克隆抗体(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA)；其他试剂为国产分析纯。BECKMAN低温离心机，酶标仪(DG3022A)，Westernblot电泳槽（北京六一厂），V-86℃超低温冰箱日本SANYO公司等。

1.32型糖尿病模型的制备

30只雄性糖尿病大鼠，饲养在22-24℃、12h：12h昼夜循环的安静环境中。适应一周后，动物随机分为3组，每组各10只。对照组大鼠给予正常的饮食饮水。糖尿病组大鼠给喂养高糖高脂饮食（成分：20%糖，10猪油%，2%胆固醇，1%胆酸钠，67%基础饲料）。一个月后，大鼠禁食12h，糖尿病组通过腹腔注射低剂量佐链脲菌素(STZ,30mg/kg)。三天后检测血糖高于16.7mmol/L为造模成功。观察大鼠一般状态，每周监测血糖、饮食、饮水量，直至实验结束。

1.4实验分组

①正常对照组(Control)；②糖尿病4周组（Dia-4w）；③糖尿病8周组（Dia-8w）。

1.5血糖测定

实验结束后，通过大鼠尾静脉采血，用血糖仪检测血糖。

1.6Westernblot检测蛋白的表达

取各组大鼠心室肌组织，液氮研磨后加入组织裂解液，4℃裂解1小时，4℃，12000g离心15分钟,取上清进行蛋白质定量。取50ug总蛋白样品于10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,随后转印至PVDF膜,用5%无脂肪牛奶封闭1小时后，分别用CaSR抗体（1:2000)、PLN（1:500）、SERCA（1:1000）、GAPDH（1:500）4℃震荡过夜。再用二抗（1：1000的羊抗兔IgG二抗；1：1000的兔抗鼠IgG二抗，碱性磷酸酶标记）孵育，室温下振荡1小时。显色，在凝胶成像系统下拍照、分析。计算各蛋白条带的光密度值，蛋白表达水平以其与内参GAPDH光密度比值来表示。

1.7统计学处理

实验数据用均值±标准差(±S)，至少进行3次独立重复试验。采用方差分析和配对t检验判断其差异显著性。全部数据统计采用SPSS17.0统计软件包进行。

2结果

2.1大鼠一般状态

实验期间，正常对照组大鼠精神状态良好，反应敏捷。糖尿病组大鼠全部出现了大量饮水，饮食增多（表1），精神萎靡不振，反应迟钝。

2.2各组大鼠血糖的测定

与正常对照组大鼠血糖相比，糖尿病4周组和8周组大鼠随机血糖显著升高（P<0.05）（表2）。

2.3心肌组织CaSR表达的变化

与正常对照组相比，糖尿病组大鼠心肌组织CaSR表达量随病程延长逐渐降低（P<0.05），同时SERCA表达逐渐减少，说明钙泵的活性逐渐降低（表3）。

3讨论

本实验通过复制大鼠DCM动物模型，观察大鼠的一般状态及饮食、饮水情况，并检测糖尿病大鼠心肌组织不同时间点CaSR及相关钙调控蛋白的表达来探讨钙敏感受体在DCM发生中的作用。我们采用高糖高脂饮食联合小剂量STZ腹腔注射的方法复制来大鼠2型DCM动物模型。与对照组大鼠相比，糖尿病4周组和糖尿病8周组大鼠都出现多食和多饮，血糖水平也明显升高。

DCM的发生机制十分复杂，迄今尚不十分清楚。CaSR是G蛋白偶联受体，其在DCM大鼠心肌的表达规律，迄今鲜见报道。本文采用Westernblot方法检测了糖尿病大鼠4周和8周时心肌CaSR蛋白的表达，结果发现糖尿病大鼠心肌CaSR蛋白的表达呈时间依赖性降低。Ward等用STZ复制的大鼠T1DM模型，2周后发现肾脏CaSR表达降低约50%[3]。由此可见，糖尿病或肥胖症大鼠其他器官同我们观察到的心肌一样，CaSR的表达也是降低的。

CaSR表达降低可造成细胞内钙的紊乱。目前认为，DCM与慢性心力衰竭一样，伴有Ca2+调控蛋白表达及活性异常[4]。SERCA是心肌细胞Ca2+处理的重要蛋白[5]。本研究发现，2型糖尿病大鼠4周和8周心肌组织SERCA表达减少，可引起SR摄取Ca2+能力下降，直接导致心肌细胞钙稳态紊乱从而造成心脏功能异常。以上研究表明2型糖尿病大鼠心肌组织CaSR表达呈时间依赖性降低，可引起钙稳态紊乱，造成心肌的进一步损伤，具体机制有待于进一步研究。

【参考文献】

[1]QiK,ZhongJ.LncRNAHOTAIRimprovesdiabeticcardiomyopathybyincreasingviabilityofcardiomyocytesthroughactivationofthePI3K/Aktpathway[J].ExpTherMed.2018,16(6):4817-4823.

[2]徐长庆，张伟华.心血管系统钙敏感受体的研究进展[J].中国病理生理杂志，2010，26（2）：409-413.

[3]WestonAH,AbsiM,HarnoE,etal.TheexpressionandfunctionofCa2+-sensingreceptorsinratmesentericartery;comparativestudiesusingamodeloftypeIIdiabetes[J].BrJPharmacol.2008，154(3)：652-662.

[4]HamiltonS,TerentyevD.ProarrhythmicRemodelingofCalciumHomeostasisinCardiacDisease;ImplicationsforDiabetesandObesity[J].FrontPhysiol.2018,9:1517-1526.

[5]SimsMWPollakAJ,LiuC,GudlurA,etal.AsecretorypathwaykinaseregulatessarcoplasmicreticulumCa2+homeostasisandprotectsagainstheartfailure[J].Elife.2018,7:e41378-41400.