背根神经节中FcγRⅠ受体参与神经病理性疼痛的机制研究

背根神经节中FcγRⅠ受体参与神经病理性疼痛的机制研究

郭雯雯1梁映霞1于剑锋1田立2王立凤1

郭雯雯1梁映霞1（通讯作者）于剑锋1田立2王立凤1

（1潍坊医学院山东潍坊261053；2潍坊市中医院山东潍坊261041）

【摘要】目的观察坐骨神经慢性压迫性损伤（chronicconstrictioninjuryofthesciaticnerve,CCI）对大鼠背根神经节（dorsalrootganglion,DRG）中Fc段γ受体Ⅰ型（Fc-gammareceptortypeⅠ,FcγRⅠ）表达的影响，初步探讨其参与神经病理性疼痛的机制。方法35只雌性Wistar大鼠随机分为7组（n=5）：空白对照组（Control）、假手术组(Sham3d,7d,14d组）、手术组(CCI3d,7d,14d组）。分别于术前、术后1d,3d,7d,10d,14d测定各组大鼠热/机械痛阈，并用Westernblotting方法检测术后各规定时间点DRG中FcγRⅠ表达变化。结果Control组和Sham组间热/机械痛阈和FcγRⅠ蛋白表达无统计学差异（P＞0.05），CCI组大鼠热/机械痛阈明显下降（P﹤0.01）伴DRG中FcγRⅠ表达量增多(P﹤0.05)。结论DRG中FcγRⅠ蛋白表达上调可能参与神经元兴奋性的提高，在神经病理性疼痛的形成与维持中发挥重要作用。

【关键词】坐骨神经慢性压迫性损伤Fc段γ受体Ⅰ型背根神经节神经病理性疼痛大鼠

【中图分类号】R745.4+2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）04-0077-03

Fc段γ受体(Fc-gammareceptor,FcγRs)是免疫球蛋白G（immunoglobulinG,IgG）Fc段的细胞受体。二者结合后可产生吞噬作用、抗体依赖性细胞毒作用、释放细胞因子、细胞脱颗粒、活化补体等作用[1，2]。FcγRs至少可分为三类，FcγRⅠ（CD64）是IgG的唯一高亲和力受体，而FcγRⅡ（CD32）和FcγRⅢ（CD16）则为低亲和力受体。

众所周知，FcγRs在免疫系统中广泛存在。近年来研究发现传统意义上的免疫赦免区-神经系统中也有IgG和FcγRs的普遍分布及表达[3]。临床发现，低剂量静脉注射免疫球蛋白（intravenousimmunoglobulin,IVIG0.5g/kg/d）对慢性疼痛、复杂区域疼痛综合征、干燥综合征相关性神经病疼痛及糖尿病神经病理性疼痛有缓解作用，且无明显不良反应[4，5，6，7]。据此推测神经系统内分布的FcγRs可能在Ig镇痛过程中发挥桥梁作用。Andoh和Kuraishi[1]研究发现，体外培养的小鼠背根神经节(dorsalrootganglion,DRG)神经元细胞有IgG高亲和力受体FcγRⅠ表达，而没有低亲和力受体FcγRⅡ、FcγRⅢ表达。本实验采用蛋白定量技术检测神经病理性疼痛模型大鼠DRG中FcγRⅠ表达的变化。

1材料与方法

1.1实验动物成年健康雌性Wistar大鼠35只（180～220g），购自山东鲁抗医药股份有限公司。于安静、温暖、湿度适宜的环境中分笼饲养，每日光照12h，自由进食、饮水，适应环境一周后进行实验。

1.2主要仪器和试剂

1.2.1仪器ElectronicVonFrey刺激仪（IITCInc.美国），SW-200光热尾痛测试仪（成都泰盟科技有限公司），PRO200型精密组织匀浆器（上海季诺科贸有限公司经销），Eppendorf台式高速冷冻离心机（德国），680型全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司），JY600C型电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司），TransferenceDecoloringShakerTS-8(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，XJX-Ⅱ型X射线摄影暗匣（上海跃进医用化学仪器厂）。

1.2.2试剂SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、彩色预染蛋白质分子量标准、超敏ECL化学发光试剂盒（碧云天）,山羊抗CD64抗体（SantaCruz,CA）,辣根酶标记兔抗山羊IgG、小鼠抗β-actin抗体、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（北京中杉金桥）,其他试剂至少为分析纯。

1.3动物分组及模型建立

1.3.1分组实验大鼠随机分为7组：空白对照组（Control组n=5）、假手术组（Sham组）、手术组（CCI组），Sham组与CCI组分设术后3d,7d,14d三个时间点，各时间点含实验动物5只。

1.3.2模型建立腹腔注射100g/L水合氯醛（0.35-0.4ml/100g）麻醉大鼠，俯卧位固定，无菌条件下于右侧大腿中下1/3处略偏外侧平行股骨切开皮肤，钝性分离肌肉，充分暴露坐骨神经并钝性分离。

坐骨神经慢性压迫性损伤（CCI组）：游离坐骨神经后，在坐骨神经干分叉处上方用4-0丝线结扎4道，间距1-2mm左右，以右下肢小腿肌肉轻度抽搐为结扎松紧度的标准。假手术组（Sham组）：只暴露游离坐骨神经，不结扎。所有实验大鼠逐层缝合肌肉后局部敷少量青霉素粉预防感染，注意保暖，待苏醒后送回鼠笼喂养，安静、温暖环境自由进饮食。

1.4行为学检测分别于术前、术后1d,3d,7d,10d,14d测定各组大鼠热/机械痛阈。

1.4.1机械痛阈用ElectronicVonFrey刺激仪检测各组大鼠右后肢机械性缩足阈值(pawwithdrawalmechanicalthreshold,PWMT)。将大鼠置于特制的透明有机玻璃隔窗中适应30min，安静后，用刺激针垂直刺激术侧后爪3、4趾间皮肤。当大鼠出现迅速缩足、躲避或添足时，仪器上显示的数据即为机械痛阈值（单位：g）。自发抬足体动不记录。

1.4.2热痛阈用SW-200光热尾痛测试仪（第100档）检测各组大鼠右后爪热痛潜伏期（pawwithdrawalthermallatency,PWTL）。光源照射大鼠术侧足底3、4趾间皮肤，当大鼠出现抬足规避反应逃离光源时，仪器自动记录下从开始照射到出现抬足反应的时间，即为伤肢热痛阈值（单位：s）。为防止大鼠足部烫伤，照射超过20s时，停止照射，痛阈记录为20s。

1.5蛋白印记（Westernblotting）检测

术后第3d,7d,14d，腹腔注射100g/L水合氯醛（0.5ml/100g）深度麻醉下断头处死大鼠，冰上迅速摘取右侧L4-6节段DRG，放入加有RIPA细胞裂解液的EP管中，匀浆离心后分离提取总蛋白，-80℃分管保存。

Westernblotting步骤如下：以每泳道80ug蛋白上样，在12%SDS-PAGE凝胶电泳分离后转印至PVDF膜上，50g/L脱脂奶粉室温封闭2小时，山羊抗CD64一抗溶液（1∶200）4℃孵育过夜，经TBST缓冲液充分洗涤后将膜置于辣根酶标记兔抗山羊IgG二抗溶液（1∶3000）37℃摇床孵育90min，经TBST缓冲液充分洗涤后用ECL试剂盒显像。内参蛋白抗体选用小鼠抗β-actin一抗（1∶500）和辣根酶标记山羊抗小鼠IgG二抗（1∶10000）。以CD64和β-actin条带的平均灰度值的比值表示CD64的相对表达水平。

1.6统计分析应用SPSS17.0软件包进行统计分析，数据以均数±标准差（x-±s）表示，组间采用两样本均数t检验，组内采用单因素方差分析（one-wayANOVA），P<0.05有统计学意义。

2结果

2.1各组大鼠热/机械痛阈检测结果术后各规定时间点，CCI组大鼠热/机械痛阈较Control组和同时点Sham组降低（P<0.01）。CCI组内热/机械痛阈差异有统计学意义(P﹤0.01)，见表1、2。

表1各组大鼠机械痛阈检测结果(x-±s,g)

*：与Control组比较有统计学意义（P﹤0.01）。

△：与同时点Sham组比较有统计学意义（P﹤0.01）。

▲：CCI组内比较有统计学意义（P﹤0.01）。

表2各组大鼠热痛阈检测结果(x-±s,s)

*：与Control组比较有统计学意义（P<0.01）。

△:与同时点Sham组比较有统计学意义（P<0.01）。

▲：CCI组内比较有统计学意义（P﹤0.01）。

2.2蛋白印记检测结果术后3d,7d,14d,CCI组大鼠DRG中FcγRⅠ蛋白表达量较Control组及Sham组上调（P<0.05）。CCI组内FcγRⅠ蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05)。Control组和Sham组比较，DRG中FcγRⅠ蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05)，见图1。

图1各组大鼠DRG中FcγRⅠ蛋白表达变化（A:Westernblotting检测结果，B：统计学结果。*：与同时点Sham组比较有统计学意义P﹤0.05，△：与Control组比较有统计学意义P﹤0.05）。

3讨论

DRG位于脊髓背根与脊神经之间，是痛觉传导的第一级中枢。它含有假单极神经元[8]，可将外周的痛觉信息传递至中枢，在神经病理性疼痛的外周敏化中发挥重要作用，同时在中枢敏化的信息传递过程中亦发挥桥梁作用。DRG不仅含有可传递疼痛感觉的神经递质和调质，还含有一些离子通道及多种起突触前调制作用的受体[9]。基于其解剖学及生理学特点，DRG是神经病理性疼痛发病机制及疼痛镇痛的研究热点。

近年来关于神经-免疫网络的研究发现，以往认为排外性地只表达在免疫细胞的免疫分子，在神经元细胞也有表达，反之亦然。基于两大系统在结构与功能上的模拟性，免疫细胞和神经细胞之间可产生信息的交流[3]。FcγRⅠ是IgG的唯一高亲和力受体，在很多炎症及免疫反应中发挥关键性作用，包括中枢神经系统的某些免疫相关疾病[2]。在DRG中，FcγRⅠ在中、小型神经元的胞体及轴突上都有表达，并且在部分神经元细胞上与疼痛相关物质如P物质(substanceP,SP)、降钙素基因相关肽(calcitoningene-relatedpeptide,CGRP)、瞬时受体电位香草酸亚型1(transientreceptorpotentialvanilloid1,TRPV1)、凝集素B4(isolectin,IB4)等共表达[2]。既往研究发现，体外培养的DRG神经元细胞可通过表达在其表面的FcγRⅠ与IgG-抗原复合物结合而直接激活[1]。研究发现，在外周感觉神经损伤或发生炎症的情况下，血清中抗原特异性IgG与抗原结合形成的免疫复合物（immunecomplex,IC）在受损组织内沉积，与DRG内分布的FcγRⅠ结合，从而活化神经元，提高其兴奋性，介导细胞内钙离子浓度升高，最终引发疼痛相关物质释放[1，2]。本研究发现，CCI损伤后大鼠热/机械痛阈明显下降，伴有DRG中FcγRⅠ表达量增多，推测FcγRⅠ参与神经病理性疼痛的发生及维持，与先前文献报道相符合。

综上所述，DRG中FcγRⅠ蛋白表达上调可能参与神经元兴奋性的提高，并在神经病理性疼痛的形成与维持中发挥重要作用。神经-免疫网络的存在可能成为神经病理性疼痛发病机制新的研究热点，也可能为疼痛的治疗提供新的途径。

参考文献

[1］AndohT,KuraishiY.DirectactionofIgGonprimarysensoryneuronsthroughFcgammareceptorⅠ［J］.FASEBJ,2004,18(1):182-184.

[2］QuLT,ZhangP,LaMotteRH,etal.NeuronalFc-gammareceptorⅠmediatedexcitatoryeffectsofIgGimmunecomplexonratdorsalrootganglionneurons［J］.BrainBehavImmun,2011,25(7):1399-1407.

[3］NiuN,ZhangJ,GuoY,etal.ExpressionanddistributionofimmunoglobulinGanditsreceptorsinthehumannervoussystem［J］.IntJBiochemCellBiol,2011,43(4):556-563.

[4］GoebelA.Immunoglobulinresponsivechronicpain［J］.JClinImmunol,2010,30Suppl1:S103-S108.

[5］GoebelA,BaranowskiA,MaurerK,etal.Intravenousimmunoglobulintreatmentofthecomplexregionalpainsyndrome:arandomizedtrial［J］.AnnInternMed,2010,152(3):152-158.

[6］MorozumiS,KawagashiraY,IijimaM,etal.IntravenousimmunoglobulintreatmentforpainfulsensoryneuropathyassociatedwithSj?gren'ssyndrome［J］.JNeurolSci,2009,279(1-2):57-61.

[7］KawagashiraY,WatanabeH,OkiY,etal.Intravenousimmunoglobulintherapymarkedlyamelioratesmuscleweaknessandseverepaininproximaldiabeticneuropathy［J］.JNeurolNeurosuryPsychiatry,2007,78(8):899-901.

[8］SapunarD,KosticS,BanozicA,etal.Dorsalrootganglion-apotentialnewtherapeutictargetforneuropathicpain［J］.JPainRes,2012,5:31-38.

[9］姜雨鸽，徐龙河，张宏.背根神经节在疼痛机制和治疗中的作用[J].国际药学研究杂志，2008,35(1):18-22

本文是山东省自然科学基金(编号：ZR2012HL27)、潍坊医学院科技创新研究基金资助课题。