L-苹果酸异构体方法学验证

L-苹果酸异构体方法学验证

李娟

西安万隆制药股份有限公司710119

【摘要】苹果酸，又名2－羟基丁二酸，由于分子中有一个不对称碳原子，有两种立体异构体。大自然中，以三种形式存在，即D－苹果酸、L－苹果酸和其混合物DL－苹果酸。苹果酸主要用于食品和医药行业。本文对高效液相色谱法拆分L－苹果酸、D－苹果酸异构体进行了研究。建立了相应的L-苹果酸异构体方法学验证，保证该方法的可靠性和可行性。[1]

【关键词】L-苹果酸；异构体；方法学

1色谱条件的确定：使用高效液相色谱法对L－苹果酸、D－苹果酸异构体进行定位、分离，DL-苹果酸分离度良好，并进行方法学验证及供试品检测。色谱条件：色谱柱：CHIRALPAKRAD-H（4.6mm×250mm，5μm）；供试品浓度：6mg/ml，流动相：正己烷-异丙醇-三氟乙酸（85：15：0.1）；流速：1.0ml/min；检测波长：210nm；柱温：30℃，进样量：20μl。[2]

2专属性及系统适用性：精密称取L-苹果酸和D-苹果酸对照品适量，加甲醇1ml溶解加流动相稀释制成浓度分别为6.12mg/ml、6.05μg/ml的混合溶液。记录色谱图，保留时间：D-苹果酸11.656分，L-苹果酸12.507分，分离度1.85。结论：L-苹果酸与D-苹果酸分离良好，空白溶剂不干扰待测溶剂的测定。

3检出限与定量限：取浓度为0.6mg/mlD-苹果酸对照品贮备液稀释制成一系列浓度的溶液。记录色谱图，S/N≈3时为检测限；S/N≈10时为定量限。D-苹果酸检出限1.0μg/ml，定量限3.0μg/ml。结论：D-苹果酸的检出限和定量限均小于控制限度，能够满足检测要求。

4线性与范围：取D-苹果酸适量加甲醇溶解，制成浓度为0.6mg/mlD-苹果酸对照品贮备液，取贮备液0.17ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、5.0ml，分别置100ml量瓶加流动相稀释制成D-苹果酸浓度在1~30μg/ml范围内的线性对照品溶液；取上述对照品溶液记录色谱图，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归。线性方程A=818.98×C-81.556相关系数R=0.9994。结论：D-苹果酸在1.0μg/ml~30.0μg/ml的范围内线性良好。

5准确度：对照品溶液1：称取D-苹果酸7.05mg置10ml容量瓶中流动相稀释，再取1ml置100ml容量瓶即为浓度7.05μg/mlD-苹果酸溶液。对照品溶液2：称取D-苹果酸6.95mg置10ml容量瓶中流动相稀释，再取1ml置100ml容量瓶即为浓度6.95μg/mlD-苹果酸溶液。供试品溶液：取D-苹果酸约6mg置10ml量瓶中加甲醇1ml使溶解再加流动相稀释，为D-苹果酸对照品溶液贮备液。称取L-苹果酸原料约600mg置100ml量瓶中，量取D-苹果酸对照品溶液贮备液0.8ml、1ml、1.2ml流动相溶解并稀释，各平行制备3份；注入色谱仪计算回收率。结论：D-苹果酸的回收率为98.24%，RSD为0.46%（n=9）含量准确度良好。

6溶液稳定性：取L-苹果酸与D-苹果酸的混合对照溶液，D-苹果酸对照品溶液，室温放置分别在0、2、4、6、8小时记录峰面积。供试品溶液：D-苹果酸峰面积RSD1.71%；L-苹果酸峰面积RSD1.88%。对照品溶液：D-苹果酸峰面积RSD3.47%。结论：溶液放置8小时内稳定性良好。

7.精密度：1）重复性：取D-苹果酸6mg置10ml量瓶中加甲醇1ml溶解后加流动相稀释为D-苹果酸对照品溶液贮备液。取L-苹果酸原料600mg置100ml量瓶中取D-苹果酸对照品溶液贮备液1ml，加流动相溶解稀释，平行制备6份为供试品溶液。另取D-苹果酸对照品约6mg，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含D-苹果酸6μg的溶液为对照品溶液。记录色谱图按外标法计算含量。D-苹果酸结果：0.07%、0.06%、0.07%、0.07%、0.08%、0.08%，重复性良好。

2）中间精密度：分别由人员A和人员B配制供试品溶液和对照品溶液，分别使用液相色谱仪甲和乙记录色谱图以外标法计算含量及RSD。结果：人员A仪器甲D-苹果酸（%）：0.10、0.10、0.10、0.10、0.10、0.10；人员B仪器乙D-苹果酸（%）：0.08、0.10、0.10、0.09、0.10、0.09。结论：D-苹果酸的RSD值为6.7%（n=6）中间精密度良好。

8耐用性：改变波长为205nm、210nm和215nm，D-苹果酸（%）：0.103、0.098、0.095RSD4.10%。改变柱温为25℃、30℃和35℃，D-苹果酸（%）：0.104、0.098、0.097RSD3.80%。改变流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min，D-苹果酸（%）：0.097、0.098、0.095RSD1.73%。结论：波长±5nm柱温变化±5℃流速±0.2ml/min，结果无明显差异耐用性良好。

9最终确定的色谱条件：异构体色谱条件与系统适用性试验用多糖衍生物为填充剂（CHIRALPAKRAD-H（4.6mm×250mm，5μm）），以正己烷-异丙醇-三氟乙酸（85：15：0.1）为流动相；检测波长为210nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；取DL-苹果酸适量，精密称定，加甲醇1ml使溶解，再加流动相稀释制成每1ml中约含DL-苹果酸6mg的溶液，作为系统适用性溶液，精密量取20μl，注入液相色谱仪，理论板数按L-苹果酸计算不低于2000，D-苹果酸、L-苹果酸峰的分离度均应符合要求。测定法取本品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1m中约含6mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取上述供试品溶液20μl，注入液相色谱仪按面积归一化法计算，其D-苹果酸的含量，应不得过0.1%。[3]

参考文献：

[1]国家食品药品监督管理局药品认证管理中心.药品GMP指南.中国医药科技出版社，分析方法的验证和确认

[2]国家药典委员会.《中华人民共和国药典》（四部）.中国医药科技出版社，2015：通则0512

[3]刁全平.高效液相色谱法拆分几种手性药物的研究[D].辽宁师范大学，2006.