酶消化法分离培养鼠牙胚间充质细胞

酶消化法分离培养鼠牙胚间充质细胞

侯景秋1闫雪丹1樊开斌2刘昱新2张慧颖2闫征斌1,

侯景秋1闫雪丹1樊开斌2刘昱新2张慧颖2闫征斌1,2

（1大庆油田总医院黑龙江大庆163001）

（2佳木斯大学口腔医院黑龙江佳木斯154002）

【摘要】目的从小鼠胎鼠的牙胚组织分离培养间充质细胞，鉴定其细胞特性。结论成功培养小鼠胎鼠牙胚间充质干细胞，体外稳定传代6代以上，有成为组织工程种子细胞的应用前景。

【关键词】牙胚间充质细胞细胞培养

牙乳头和牙囊由颅神经嵴细胞迁移分化而来，最终分化为成牙本质细胞、成牙骨质细胞和牙周成纤维细胞，是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，具备作为牙组织工程种子细胞的应用前景。本研究从小鼠胎鼠下颌第一磨牙牙胚中分离外胚间充质细胞，酶消化法培养，鉴定其外胚间充质干细胞特性和分泌形成基质蛋白能力，旨在为下一步在牙组织工程中的应用奠定基础。

1材料和方法

1.1材料

DMEM／F12培养基（D/F12）、胎牛血清（FBS）、鼠抗CD57/HNK-1单抗、鼠抗波形丝蛋白单抗，FITC荧光标记羊抗鼠IgG二抗。

1.2方法

1.2.1取材与培养

1.2.1.1机械法分离胎鼠牙胚间充质

1.2.1.2细胞培养方法

酶消化法培养剩余之牙胚间充质剪切成0.5cm3大小组织块。37.5℃条件下2.5g／L胰蛋白酶－1mmol／LEDTA消化20～30min，不断振摇。血清中和并反复吹打后将细胞悬液经过100μm细胞过滤器和3600rpm离心10分钟收集细胞。以培养液吹打成细胞悬液,调整细胞浓度为5×105/ml后接种于培养瓶中。37.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养，2－4天换液一次。

细胞传代当细胞长满瓶底80％时，弃培养液，37.5℃以2.5g／L胰蛋白酶消化3min，培养液中和并吹打均匀，细胞计数，调整为5×105/ml浓度后1：3传代。

1.3观测指标

1.3.1倒置显微镜观察细胞形态

原代细胞贴壁后,每天在倒置显微镜下观察细胞形态，记录生长状况。

1.3.2记录生长曲线并计算细胞倍增时间

1.3.3免疫组化鉴定细胞表面标志

1.3.4端粒酶活力测定

2结果

2.1细胞生长和形态观察

原代细胞接种于培养瓶后，20min后即开始贴壁，4h后细胞开始铺展，24h后细胞铺展率>3／4，细胞呈梭形和多角形，2～4个细胞突起，胞体丰满，单细胞核细胞居多。8～12d后细胞可相互汇合铺满瓶底80％，1：3消化传代后细胞形态与传代前基本一致。

2.2生长曲线与细胞倍增时间

细胞生长曲线呈“S”形，第3～5d细胞处于增殖期。经计算，酶消化法为2.36±0.34d。

2.3细胞表面标志鉴定

免疫细胞化学染色见培养细胞CD57/HNK-1、波形丝蛋白表达阳性，均为胞浆着色。

2.4端粒酶活力测定

端粒酶原位杂交显示部分细胞表达较高端粒酶活性，图像分析计数计算第3代细胞端粒酶表达比例为42.3±12.4％。

3讨论

单纯胰蛋白酶消化牙胚，往往对牙胚细胞造成伤害。组织学实验证明，胰蛋白酶消化后的牙乳头不能继续发育，而胰蛋白酶＋EDTA消化的牙胚则不受影响。消化后牙胚上皮容易撕脱，即可得到较完整的牙乳头和牙囊。实验中酶消化法第3代细胞纯度均可达到95％以上，说明采用机械法分离较为彻底，可以基本去除上皮和下颌突间充质的干扰，能满足对牙胚间充质干细胞进一步研究的需要。

端粒酶（Telomerase），在生殖细胞、干细胞和肿瘤细胞中高度表达，是这些细胞能够不断分裂增殖的主要原因。目前，85％的恶性肿瘤细胞中已发现了端粒酶活性的表达，而与肿瘤相邻的正常组织细胞或良性病变中仅为4％左右，同样的，在干细胞研究中也发现了端粒酶的高表达，某些细胞系表达率高达90％以上。因此，端粒酶的功能活动决定了干细胞的生物学特点，端粒酶的表达可以反映细胞的增殖和自我更新能力，是干细胞的重要特点之一。本实验中，第3代细胞端粒酶表达比例在42.3％，明显高于正常组织中表达量，说明培养细胞中有较大量干细胞成分。

本研究结果表明，采用机械法分离15.5日胎龄小鼠胎鼠下颌第一磨牙牙胚间充质，酶消化法培养，可以获得高纯度牙胚间充质干细胞。牙胚间充质干细胞为梭形或多角形，增殖能力活跃，均一性表达外胚间充质干细胞表面标志CD57／HNK-1，同时表达波形蛋白，具有较高的端粒酶活性，原代培养形状稳定，有作为牙组织工程种子细胞的应用前景。

参考文献

[1]LiuW,CuiL,CaoY.AcloserviewoftissueengineeringinChina:theexperienceoftissueconstructioninimmunocompetentanimals.TissueEng.2003,9(Suppl1):S17-30.

[2]ChaiY,SlavkinHC.Prospectsfortoothregenerationinthe21stcentury:aperspective.MicroscResTech.2003,60(5):469-79.