酪氨酸激酶抑制剂对C6胶质瘤细胞的抑制作用的实验研究

酪氨酸激酶抑制剂对C6胶质瘤细胞的抑制作用的实验研究

鲁春鹤赵江唐海涛刘波陈刚李明

鲁春鹤赵江唐海涛刘波陈刚李明（大庆油田总医院神经外科黑龙江大庆163001）

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）19-0104-03

【摘要】目的观察酪氨酸激酶抑制剂AG490对大鼠C6胶质瘤细胞增殖、凋亡的抑制作用。方法构建不同浓度酪氨酸激酶抑制剂AG490作用于不同时段的C6模型。并用MTT法对各组细胞模型进行细胞增殖检测；用凯基AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒及流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡检测。结果酪氨酸激酶抑制剂可明显抑制胶质瘤细胞C6的细胞增殖，并使肿瘤细胞的存活率降低，对胶质瘤细胞增殖和存活率的抑制作用具有浓度效应（P<0.05）；流式细胞仪检测结果提示其能够诱导胶质瘤细胞株发生凋亡。结论酪氨酸激酶抑制剂对C6胶质瘤细胞株的增殖、凋亡有密切联系。

【关键词】酪氨酸激酶抑制剂胶质瘤细胞增殖凋亡

胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，由于其侵袭性生长，术后复发并呈进行性恶性程度增加，现有治疗手段效果不佳。目前认为，胶质瘤在多个基因的不同环节上发生异常，胶质瘤细胞在增殖、分化和凋亡等重要生物学过程中缺乏正常的基因调控而出现细胞的恶性增殖和侵袭生长。研究表明表皮生长因子(Epidermalgrowthfactor,EGF)、血小板源性生长因子及其它的酪氨酸激酶如Src等细胞因子与相因受体结合后，诱发受体的二聚化在胞浆内结合Janus激酶(Jams-skinase,JAK)并引发自身和JAK的酪氨酸磷酸化[1]，而磷酸化的受体或JAK会诱导相应基因如抗凋亡基因Bcl-xl,Mcl-1;细胞周期调控基因C-myc,CyclinD1以及血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)等的表达[2-3]。因此Janus激酶的抑制剂即AG490理论会通过多种途径抑制胶质瘤细胞增殖、促进凋亡，表现出抑癌作用。本实验研究旨在观察观察酪氨酸激酶抑制剂AG490对大鼠C6胶质瘤细胞增殖、凋亡的抑制作用。为临床应用JAK激酶抑制剂治疗神经胶质瘤提供实验依据。

1实验材料和方法

1.1主要试剂及药物

胶质瘤细胞株C6细胞(由中国医科大学附属第一医院神经外科提供)

DMEM培养液（GIBCO,InvitrogenCorp.NY,USA）

10%胎牛血清（GIBCO,InvitrogenCorp.NY,USA）

DMSO,二甲基亚砜(SinopharmCorp.Shanghai,China)

75%乙醇(SinopharmCorp.Shanghai,China)

0.25%胰酶(Sigma,SigmaaldrichCorp.St.Louis,USA)

AG490(Calbiochem,USA)

Giemsa染色剂（Sigma,SigmaaldrichCorp,St.LouisUSA）

MTT溶液（Sigma,SigmaaldrichCorp,St.Louis,USA）

凯基AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）

1.2主要仪器设备

超净工作台VS840K:Antai,China

CO2培养箱HeraCell150:Thermo,USA

冷冻离心机SorvallSuperT21:Thermo,USA

-86℃冰箱Forma-86ULTFreezer:Thermo,USA

流式细胞仪BDFACSCaliburCellSortingSystem

水平及垂直电泳仪，Biorad湿转仪及摇床等。

1.3AG490作用于C6细胞模型的建立用DMSO溶解AG490粉末配制成10mM溶液，4℃冰箱保存。胶质瘤细胞C6根据实验需要接种于6孔－96孔板，细胞投入量根据培养板的品种和需要观察的时间而定。用含10%血清的DMEM培养24小时以便细胞贴壁。用培养液稀释10mMAG490使最终浓度分别达到25μM，50μM，100μM，以不加药为对照组。AG490加入后充分摇匀，以便同一培养孔内细胞对药物的反应一致。加药和不加药的肿瘤细胞继续在其他条件完全相同的情况下培养。根据需要于加药后24h、48h、72h取出进行下一步实验。

1.4MTT法检测细胞存活率本实验中各组不同浓度AG490处理C6细胞组和对照组细胞在不同时间点进行MTT检测:①各组细胞2.0×103个分别接种于96孔板，每组分别设5个重复孔；②37℃，5%CO2培养，分别于24h、48h、72h后终止培养；③每孔中加入MTT20μl(5mg/ml)，37℃条件下再培养4h；④弃上清，每孔加DMSO150μl，锡纸避光振摇10min；⑤选择570nm波长全自动酶标仪测定各孔光吸收值，保存结果。

1.5对C6细胞凋亡影响的检测将C6胶质瘤细胞接种于6孔板，约2.0×105/孔。尽可能在接种时让各孔细胞数保持一致。细胞接种后培养24小时，肿瘤细胞贴壁后每孔中加入AG490，使终浓度为100μM，以不加药为对照。用含5%血清的DMEM在37℃、5%CO2条件下继续培养。

1.6细胞凋亡检测采用AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒。悬浮细胞离心（2000rpm，5min）收集；用PBS洗涤二次（离心2000rpm，5min）收集2.5×105个细胞；加入500μL的BindingBuffer悬浮细胞；加入5μLAnnexinV-FITC混匀后加入5uLPI，混匀；室温，避光，反应15min；1h内，流式细胞仪检测，激发波长488nm；发射波长530nm。

1.7统计分析所有数据以均数±标准差（x-±SD）表示，采用SPSS16.0及Excel统计软件进行数据处理，组间比较用单因素方差分析(ANOVA)，在单因素方差分析有意义的基础上再进行组间两两比较，两变量之间相关关系行Spearman相关分析，Р<0.05为差异显著。

2结果

2.1AG490阻断STAT3信号通路对C6细胞增殖和存活率的作用AG490可明显抑制胶质瘤细胞株C6的细胞增殖，并使肿瘤细胞的存活率降低。单因素方差分析的结果显示AG490对胶质瘤细胞增殖和存活率的抑制作用具浓度效应，P值具有统计学意义。因而，AG490能够抑制胶质瘤细胞株增殖并使肿瘤细胞存活率降低。

表1MTT法检测AG490C6细胞增殖OD值（x-±SD）

组别AG490浓度

对照25μM50μM100μM

24h0.475±0.0600.389±0.0520.337±0.0450.256±0.065

48h0.654±0.0710.563±0.094＊0.425±0.070＊0.350±0.067＊＊

72h0.805±0.0640.711±0.056＊＊0.557±0.042＊＊0.459±0.093＊＊

注:与对照组比较，*P<0.05﹡**P<0.01

图1，AG490对C6细胞增殖的抑制作用MTT检测所得OD值的不同反映出各组间活细胞相对数量的高低*为P<0.05，**为P<0.01

2.2AG490对胶质瘤细胞凋亡的作用C6细胞在不同浓度AG490的培养液中培养48小时后在相差显微镜下观察，并用流式细胞仪对细胞凋亡进行检测；在用AG490处理的胶质瘤细胞中，显微镜观察可发现细胞形态和数量的明显变化。流式细胞仪检测结果显示：(图2)检测C6细胞凋亡的比例都高于不用AG490的对照组。此外，C6细胞株中细胞的凋亡比例均随AG490浓度的提高而升高。因此，AG490能够诱导胶质瘤细胞发生凋亡。

CTRL50μM100μM

图2，AG490作用C6细胞48小时后FCM检测结果

3讨论

AG490是一种新近人工合成的酪氨酸激酶的抑制剂。近年的研究表明AG49O具有多方面的研究价值和临床价值。从文献看[4-7]，采用AG490进行研究的范围已涉及生物学的很多方面，包括抗肿瘤研究、免疫反应机制研究等，都是近年来的研究热点。本实验选择AG490作用于C6胶质瘤细胞，观察胶质瘤细胞株在生长、增殖、凋亡所发生的变化。在肿瘤研究中，通常需要通过细胞增殖试验来检测人为干预前后肿瘤细胞生长和存活的变化情况[8]。细胞增殖试验中，MTT(Methylthiazolyte-trazolium法是最常用的检测方法，检测结果可以较好地反映存活细胞的数量[9]。新的筛选抗癌药物的方法恶性肿瘤与正常组织在生物学特征上的重要区别在于肿瘤细胞不仅具有无限复制潜能，而且能够逃避凋亡，以至于无限增殖、失控生长。所以如何促进肿瘤凋亡是肿瘤治疗的研究重点。本研究采用AnnexinV-FITC试剂盒检测肿瘤细胞凋亡，ArmeXinV法用于早期凋亡细胞的检测非常敏感。随着细胞凋亡过程的进展，大量晚期凋亡的细胞进入破碎死亡的阶段，在FCM检测的结果中则显示为细胞碎片或死细胞。随着较多细胞进入晚期凋亡或细胞溶解，FCM检测就出现细胞碎片和死细胞的比例升高而凋亡细胞的比例增加不多的情况。从检测的情况看，AG490浓度越高，凋亡细胞越多。对AG490作用时间与凋亡程度的观察发现，100μM的AG49O作用48小时的C6中凋亡细胞的比例高于50μM的AG490作用48小时的C6细胞组。各种现象表明，用AG490能够诱导胶质瘤细胞株发生凋亡。综上所述，酪氨酸激酶的抑制剂在功能上参与了肿瘤细胞凋亡和细胞周期进程的调控，其能造成肿瘤细胞周期的阻滞和肿瘤生长的抑制的现象是基本一致的，这是将酪氨酸激酶抑制剂作为胶质瘤治疗的新方法的一个重要依据。

4结论

本研究应用酪氨酸激酶抑制剂AG490干预C6胶质瘤细胞，以了解该因素在促进胶质瘤发生发展中的作用。结果证实：使用AG490能够有效地抑制C6胶质瘤细胞株的增殖，肿瘤细胞的存活率下降，促进凋亡。酪氨酸激酶抑制剂在功能上与恶性肿瘤生物学特性有着内在的联系，涉及到肿瘤发生、发展的多个重要环节。针对它的进一步深入研究很有可能为胶质瘤的治疗提供更有效更安全的新方法，可能成为抑制胶质瘤侵袭性生长的有效治疗靶点。

参考文献?

[1]RawlingsJS,RosierK.HarrironDA.TheJAK/STATsignalingpathway.JCellSci.2004;117(Pt8):1281-1283.

[2]EnksenKR,KalhiftK,MikkelsenG,etal.ConstitutiveSTAT3-acovationinSezarysyndrome:tyrphostinAG490inhibitsSTAT3-activatein,interleukin-2receptionexpressionandgiathofleukemicSezarycells.Leukemix.2001;15(5):787-793.

[3]AhnKS,SethiG,SungB,etal.GuggulsteroneafamesoidXrecephmantagonistinhbitsconstitutiveandinducibleSTAT3activationthroughinductionofaproteintyrosinephophahseBSHP-1.CancerRes.2008;68(11):4401-415.

[4]KbsekSK,NakashiroK,HaraS,etal.STAT3asamoleculartargetmRNAinterference-basedtreatmentoforalsquanouscellcarcinoma.OncolRep.2008;20(4):873-878.

[5]NatarajanC.SignalingthroughJAK2-STATSpathwayisessentialforIL-3-inducedactivationofmicroglia1ia.2004;45(2):188-196.

[6]HoltickU,VockerodtM,PinkertD,etal.STAT3isessentialforHodgkinlymphomacellproliferationandisatargetoftyrphostinAG17whichconferssensitizationforapoptosis.Leukemia.2005;19(6):936-44.

[7]DowlatiA,NetheryD,KernJA.CombinedinhibitionofepidermalgrowthfactorreceptorandJAK/STATpathwaysresultsingreatergrowthinhibitioninvitrothansingleagenttherapy.MolCancerTher.2004,3(4):459-463.

[8]SaitoK,IwashitaJ,MurataJ,etal.ThetyrosinekinaseinhibitorAG490inhibitsgrowthofcancercellsandactivatesERKinLS174TandHT29cells.AnticancerRes.2006;26(2A):1085-1090.

[9]SahaNR,UsamiT,SuzukiY.Adoublestainingflowcytometricassayforthedetectionofsteroidinducedapoptoticleucocytesincommoncarp(Cyprinuscarpio).DevCompImmunol.2003;27(5):351-363.