清咽润喉止咳糖浆微生物限度检查方法的验证

清咽润喉止咳糖浆微生物限度检查方法的验证

张雪峰1胡燕1陈海红

张雪峰1胡燕1陈海红2（1江苏省海门市人民医院江苏南通226100；2江苏省海门市中医院江苏南通226100）

【摘要】目的：建立清咽润喉止咳糖浆的微生物限度检查方法,并对方法进行验证。方法：采用培养基稀释法(0.2mL/皿)进行细菌限度检查,采用常规法进行霉菌及酵母菌限度检查；采用常规法进行控制菌(大肠埃希菌)检查。结果：验证实验中各类菌的回收率均大于70%。结论：该方法有效可行,可用于该品种的微生物限度检查。

【关键词】清咽润喉止咳糖浆微生物限度检查方法验证【中图分类号】R927【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）36-0028-02清咽润喉止咳糖浆（苏药制字Z04001344）是临床使用多年的医院制剂,由青果、玄参、麦冬、杏仁、等十三味药组成,具有清咽润喉、润肺止咳之功效,临床主要用于慢性咽炎、咽痒咽干，干咳无痰等症的治疗。根据《中国药典》2010年版(一部)微生物限度检查法规定,在建立药品的微生物限度检查法时,应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法的验证,以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定和控制菌的检查,笔者查阅了有关文献[1、2]并经过多次实验,确定了清咽润喉止咳糖浆微生物限度的检查方法,更进一步保证了该制剂的质量。

1仪器与材料PYX-DHS细菌培养箱（上海市医疗器械一厂）；MJ-160B霉菌培养箱（上海跃进医疗器械厂）；Bs-600L电子天平（上海友声衡器有限公司）；ZF-Ⅰ型三用紫外分析仪（上海顾村电光仪器厂）；SWCJ-IC型净化工作台（苏州吴净空调净化设备厂）。

试验菌种：大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）[CMCC(B)63501]、白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC(F)98001]、黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC(F)98003],由中国药品生物制品检定所提供。

营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、改良马丁液体培养基、胆盐乳糖培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基、MUG培养基、改良马丁琼脂培养基,由中国药品生物制品检定所提供。

2方法[3]2.1菌液制备2.1.1取经35℃培养18～24h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜营养肉汤培养物1mL,用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5～10-7,约为50～100cfu?mL-1,做活菌计数备用。

2.1.2取经25℃培养24～48h的白色念珠菌改良马丁液体培养物1mL,用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5～10-6,约为50～100cfu?mL-1,做活菌计数备用。

2.1.3取经25℃培养1周的黑曲霉改良马丁斜面培养物,加0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-4,约为50～100cfu?mL-1,做活菌计数备用。

2.2供试液制备取供试品10g加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90mL,摇匀,作为1:10供试液备用。

2.3细菌、霉菌和酵母菌计数方法（平皿法）的验证2.3.1试验组取1:10供试液1mL和上述制备好的阳性对照菌液1mL置平皿中,加入营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基(白色念珠菌用改良马丁琼脂培养基),混合均匀,放置凝固后,置规定的温度培养至规定的时间,逐日观察结果,做菌落计数。

2.3.2菌液组分别取实验菌lmL注入平皿中,立即琼脂培养基,每种实验菌平行制备2个平皿,待凝固后,置规定的温度培养至规定的时间,逐日观察结果,做菌落计数。

2.3.3供试品对照组取“2.2项下”1:10供试液lmL置平皿中,立即倾注琼脂培养基,待凝固后,置规定的温度培养至规定的时间,逐日观察结果,测定供试品本底菌数。

2.3.4稀释剂对照组取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1mL置平皿中,加入营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基(白色念珠菌用改良马丁琼脂培养基),混合均匀,放置凝固后,置规定的温度培养至规定的时间,逐日观察结果。

2.3.5回收率的计算试验组的加菌回收率（%）=(试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数×100%；稀释对照组的加菌回收率（%）=稀释对照组的平均菌落数/菌液组平均菌落数×100%。结果见表1。

表1清咽润喉止咳糖浆细菌、霉菌和酵母菌回收率的测定（平皿法）

2.4培养基稀释法：取1:10供试液2mL,每毫升供试液等量分注5个平皿,每10个平皿为1组,即按培养基0.2mL稀释法进行微生物限度检查方法验证。取上述制备好的金黄色葡萄球菌阳性对照菌液1mL,分组注入平皿中,倾注琼脂培养基,混匀,凝固后,倒置培养。计算回收率。经实验证明,采用培养基0.2mL稀释法,金黄色葡萄球菌的回收率均>70％,故细菌可采用培养基稀释法进行微生物限度检查。结果见表2。

表2清咽润喉止咳糖浆细菌回收率测定（培养基稀释法0.2mL/皿）

2.5控制菌检查方法的验证2.5.1供试液的制备同“2.2”项下1:10供试液的制备。

2.5.2试验组取1:10供试液10mL,加入上述大肠埃希菌液50～100cfu,置100mL胆盐乳糖培养基中,35～37℃培养24h。取上述培养物0.2mL,接种至含5mLMUG培养基的试管中培养,于5h、24h在366nm紫外线下观察有荧光反应。沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液,液面呈玫瑰红色。

2.5.3阴性菌对照组取1:10供试液10mL,加入上述金黄色葡萄球菌50～100cfu,置100mL胆盐乳糖培养基中,35～37℃培养24h。

取上述培养物0.2mL,接种至含MUG培养基的试管中培养,于5h、24h在366nm紫外线下观察无荧光反应。沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液,液面呈试剂本色。结果见表3。

表3控制菌(大肠埃希菌)检查方法验证结果

上述验证结果表明,试验组检出了大肠埃希菌而阴性菌对照组未检出金黄色葡萄球菌。说明可采用常规法对本品进行控制菌(大肠埃希菌)检查。

2.6结果根据以上实验得出该品种微生物限度检查方法为：取供试品10g加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90mL,摇匀,作为1:10供试液。采用培养基稀释法(0.2mI/皿)进行细菌限度检查,采用常规法进行霉菌及酵母菌限度检查；控制菌(大肠埃希菌)检查亦采用常规法。

3讨论由于本供试品对金黄色葡萄球菌具有明显抑制作用,采用常规法不能消除其抑菌性,故采用培养基稀释法(0.2m/皿)进行微生物限度检查方法验证,经过3次独立平行实验,结果显示金黄色葡萄球菌的回收率均>70％,因此可采用培养基0.2mL稀释法进行清咽润喉止咳糖浆细菌的微生物限度检查。

参考文献[1]宋嵩文,黎强,庞兴寿,等.咳特灵胶囊微生物限度检查方法的验证[J].中国药师.2008,11(11):1379-1380[2]汤大妹,汪键,赵勤,等.参味合剂微生物限度检查方法的验证.实用临床医药杂志.2010,14(1):69-70[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京：化学工业出版社,2010：附录79-88