绿色荧光蛋白作为标记蛋白在胰岛素表达的初步研究

绿色荧光蛋白作为标记蛋白在胰岛素表达的初步研究

吴宇娟荣曦张君周秋利刘红（通讯作者）

吴宇娟荣曦张君周秋利刘红（通讯作者）

（广西医科大学第一附属医院老年内分泌科广西南宁530021）

【摘要】目的探讨绿色荧光蛋白作为标记蛋白其荧光强度与胰岛素表达量的相关性。方法构建重组质粒prIns1EGFP，转染HIT-T15仓鼠胰岛瘤细胞，随机分为3组，低糖组（LG）、中糖组（MG），高糖组（HG）,检测基线0小时及葡萄糖刺激后4小时内胰岛素分泌量及单个胰岛β细胞荧光强度。结果HG组单个胰岛β细胞荧光强度，胰岛素分泌量较LG组明显增强（P＜0.05），在一定葡萄糖浓度范围内，绿色荧光蛋白其荧光强度随着葡萄糖浓度的升高而升高，并与细胞胰岛素分泌量呈明显的正相关，相关系数R为0.896。（P＜0.05）结论绿色荧光蛋白作为分子标记物其荧光强度与胰岛素分泌量有正相关性。

【关键词】绿色荧光蛋白细胞转染相关性胰岛素

【中图分类号】R39【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）07-0157-02

细胞作为生命体结构基本单元，要了解一些生命活动规律，就须以细胞为研究基础，要对单细胞进行分析，可引入荧光标记蛋白。绿色荧光蛋白（GFP）是近年来在生物化学和细胞生物学中应用最广泛的标记蛋白之一[1]，常被用于研究单个细胞的蛋白表达或者转染后基因的表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等[2]，免疫分析、核酸碱基探针分析，以及分子间第二信使钙离子和cAMP水平的指示,荧光关联谱学、细胞分类选择和细胞系分析，细胞间隙pH变化的检测[3]，用于研究转染后基因的表达，可通过荧光显微镜观察或流式细胞仪定量检测，可对细胞内绿色荧光蛋白表达水平进行半定量的检测[4]，该方法简单有效。但应用中仍有问题亟待解决，荧光信号强度的非线性性质使得定量非常困难，目前通过检测绿色荧光蛋白的荧光强度来定量检测转染后单个细胞内蛋白质的量仍无明确报道。为进一步探讨绿色荧光蛋白作为标记蛋白其荧光强度与胰岛素表达量的相关性，本实验用重组质粒prIns1EGFP转染HIT-T15细胞后，在荧光显微镜下连续4小时实时监测单个胰岛细胞的荧光强度情况。

材料与方法

一、实验材料

HIT-T15仓鼠胰岛瘤细胞（美国ATCC细胞库），Lipofeltamine2000（inventrogen），重组质粒prIns1EGFP，免疫组化试剂盒，1640培养基、胎牛血清（GIBCO公司）；荧光显微镜（Olmpus），恒温灌流系统，二氧化碳恒温细胞培养箱（HERAUESEKType）；孔板。

二、实验方法

2.1瞬时转染以细胞密度为1×106/mL种于24孔板内。加入含10%胎牛血清、1mmol/l的L-谷氨酰胺的1640培养基，恒温培养箱中培养24h。转染前2h把孔板中的培养基换成无血清无双抗的基础培养基，将重组质粒prIns1EGFP2uL和LipofectaminTM20002μL分别溶解在48uL培养基中制成转染液，室温孵育5分钟后混匀，再孵育20min，转染24孔板，6h后换普通培养基，20h可观察荧光。

2.2实验分组：分为三组：低糖组（LG）含糖2.8mmol/L，中糖组（MG）含糖5.6mmol/L，高糖组（HG）含糖16.7mmol/L。

2.3本实验为保证细胞活性，引用恒温灌流系统（LiveCellMicroscopyEnvironmentalControlSystems），该设备包含二氧化碳泵，恒温加热皿，加热探头及微量灌流泵等，可保证细胞在37℃,5％CO2及持续微量的培养基灌流的环境下生存。

2.4荧光强度的测定

葡萄糖刺激后，固定视野，用荧光显微镜连续4小时（间隔0.5h拍1张）拍照，用NIS-ELEMENTSViewer软件分析荧光强度。

2.5胰岛素释放量的测定

各组细胞予葡萄糖刺激后间隔1h收集细胞孵育液，-20℃保存。用化学发光试剂盒测定培养液中胰岛素浓度。

三、统计学分析

用SPSS16.0软件分析。数据以均数±标准差(x-±s)表示。多组间比较应用多因素方差分析。荧光强度与胰岛素分泌量的相关性分析，两组间均数比较采用SNK，P<0.05为差异有统计学意义。

四、结果

1、糖刺激后荧光强度测定

糖刺激后，低糖组随刺激时间延长，荧光强度无明显改变（P＞0.05）。高糖组较低糖组荧光强度明显增高，差异有统计学意义（P<0.05），高糖组荧光强度随时间延长而逐渐变亮，约在糖刺激后2.5h左右达峰值。

2、糖刺激后胰岛素分泌量测定

糖刺激后HG组较LG组MG组胰岛素分泌量明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。LG组胰岛素分泌量随时间延长无明显改变（P＞0.05）。

3、荧光强度与胰岛素分泌量相关性分析

线性相关分析的数据显示，不同浓度的葡萄糖刺激单个胰岛细胞的荧光强度与胰岛素分泌量具有相关性，其相关系数r为0.896，P＜0.05。

讨论

在体外转染实验中，人们需要了解细胞内蛋白质的表达水平，传统的检测蛋白质的方法操作麻烦，以往对细胞群体研究葡萄糖刺激胰岛素分泌情况，会掩盖了单细胞间的差异不能很好的从单细胞水平来反应蛋白质水平，单细胞分析的引入对与疾病的早期预防和诊断有重要的意义，在临床，细胞生物学及神经生物学等多个领域都有重要意义。本实验构建了重组质粒并转染细胞后,在恒温灌流系统下，通过EGFP长时间对单个胰岛细胞进行实时观察。

本实验目的是测定细胞的荧光强度来反应细胞内胰岛素的表达水平，该方法不依赖大型仪器，能在短时间内大致的反应出胰岛素的分泌量。结果显示，样品的荧光强度与胰岛素浓度有很好的线性关系，说明可以用荧光强度来衡量胰岛素的表达水平，既往对转染后基因表达的研究，可通过荧光显微镜观察或流式细胞仪对细胞内绿色荧光蛋白表达水平进行半定量的检测，但是由于EGFP的荧光强度会受到外界多方面因素的影响，本实验优化了各种可能影响荧光强度的因素。

Brundstedt等发现高浓度葡萄糖刺激HIT-T15细胞2h后会导致胰岛素mRNA水平明显增加，胰岛素原的合成率将升高10左右。

Barbara等通过应用胰岛素启动子驱使的绿色荧光蛋白表达质粒进行短期葡萄糖刺激诱导胰岛细胞胰岛素基因转录的研究，发现高糖刺激后胰岛素mRNA水平能在1至2小时升高2到5倍，荧光强度增强2倍左右，本研究表明，重组质粒在胰岛素基因的生物合成研究中意义重大，通过转染技术将其导入胰岛β细胞后，能实现对葡萄糖诱导的胰岛素基因转录的实时监测，即检测荧光蛋白的表达可以间接反映胰岛素的生物合成情况，但因GFP的荧光信号强度为非线性性质，使得定量非常困难，通过荧光强度准确的定量出胰岛素表达量还有待研究。

参考文献

[1]ChalfieM,KainS.Greenfluorescentprotein:properties,applicationsandprotocols.NewYork:WileyLiss,1998;83.

[2]HeimR,CubittAB,TsienRY.Improvedgreenfluorescence.Nature,1995;373:663.

[3]HermanPS,HelmiRMS,CristinaPB,etal.UseofGFPtostudyfactorsinvolvedinthelotusjaponicussymbiosis[J].CurrentPlantScienceandBiotechnologyinAgriculture,2006,38:219-222.

[4]TomboliniR.,UngeA.,etal.FlowcytometricandmicroscopeanalysisofGFP-taggedPseudomonasfluorescensbacteria[J].FEMSMycrobiol.Ecol.,1997,22:17-28.