骨形态发生蛋白2诱导鼠胚胎间充质干细胞成骨分化的分子机制研究

骨形态发生蛋白2诱导鼠胚胎间充质干细胞成骨分化的分子机制研究

谢在春1周迎春1卢卫国1何伟业1刘基铎1孙奋勇2

谢在春1周迎春1卢卫国1何伟业1刘基铎1孙奋勇2

(1广州中医药大学第一附属医院检验科广东广州510405)

(2上海市第十人民医院检验科200071)

【摘要】目的探讨骨形态发生蛋白2（BMP2）诱导鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2的成骨分化能力。方法培养C3H10T1/2，用20μg/mlBMP2对其诱导一定时间后，Westernblotting检测smad蛋白及信号通路中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）p38的水平变化，QRT-PCR检测成骨标志基因碱性磷酸酶（ALP）表达情况，茜素红染色，观察诱导晚期细胞矿化情况。结果经BMP2诱导后，C3H10T1/2细胞成骨终末期分化标志矿化情况(茜素红染色)显著增加，smad蛋白及p38磷酸化水平有所上升，成骨标志基因ALP表达水平有明显提高。结论BMP2具有诱导C3H10T1/2细胞成骨分化能力，对BMP、Smad通路有一定依赖性。

【关键词】骨形态发生蛋白C3H10T1/2细胞成骨分化

【中图分类号】R446.8【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）17-0061-02

骨形态发生蛋白(BMP)，是转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员之一，具有多种生物学功能[1]，其中目前研究较多的是与骨的再生及修复相关的BMP2。在骨组织形成过程中,BMP2有促进成骨细胞分化和诱导体外成骨的能力。它使未分化的间质细胞经过趋化、分裂和分化三个环节不可逆地分化成软骨细胞和成骨细胞,诱导新骨生成[2]。

C3H10T1/2细胞是鼠胚胎未分化的间充质干细胞，在不同的诱导因素作用下可向不同的细胞系包括成骨细胞，成软骨细胞以及成脂肪细胞分化[3]，增殖能力好，本实验选用其做为诱导分化成骨的模型。

BMP2诱导C3H10T1/2细胞成骨分化已见报道[4，5]，但未从分子机制进行深入研究，本文从细胞及分子水平分别对BMP2诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化的条件及分子机制进行研究，进一步探讨成骨分化机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂

Westernblotting试剂盒（Pierce），DMEM培养基(Tiangen)，胎牛血清（Gibco）。PCR仪(ABI9700)。BMP2由暨南大学生工所研制，茜素红(Sigma)，Trizol试剂(Tiangen)逆转录酶TIANScriptM-MLV（Tiangen），荧光定量PCR用多聚酶SYBRPremixExTaq（Takara）。Smad1/5/8,p38磷酸化抗体（Tiangen）

1.1.2PCR引物由上海生工合成。

ALPF:5，GTACTGGCCATCGGCACCTG3’R:5，CAGCGGTTACTGTGGAGACG3，

Smad1F:5，CTGAAGCCTCTGGAATGCTG3，R:5，GTGGCGTTCAGTGGCATGTG3，

Smad5F:5，GTGCTATGGAGGAGCTGGAG3，R:5，TCCAGGTCCAGAGCTTGCTG3，

Smad8F:5，CATTACCGCAGAGTGGAGAC3，R:5，GGACTGTCTGAAGGACTTCC3，

1.2方法

1.2.1C3H10T1/2细胞培养及诱导

将细胞接种于6-Well培养板中培养24h后，加入20μg/mL的BMP-2进行诱导，每隔2d换液，追加20μg/mL的BMP2诱导，于4h，1d，2d，3d，4d，5d，6d后收集细胞备用。

1.2.2荧光定量RT-PCR

将培养1d，2d，3d，4d，5d，6d经BMP2诱导与未诱导细胞用抽提RNA，进行逆转录。荧光定量PCR反应体系：2×PCRpremix20μl,Primers1.6μl,cDNA2μl，ddH20补平体积40μl；反应条件：95℃9min,95℃16s，60℃62s，共48个循环。

1.2.3Westernblottting

将培养4h经BMP2诱导与未诱导的细胞加入细胞裂解液裂解，将裂解细胞，β－巯基乙醇，上样缓冲液以3：1：1比例混合，煮沸5min，10000rpm离心5min，取上清电泳。电泳条件：110v10min,180v35min。转PVDF膜，电转条件：90v200mA3h。将膜浸入封闭液1h，再浸入抗β－actin，抗磷酸化Smad1/5/8,p38，12h。T-TBS清洗后浸入二抗1h。T-TBS清洗后加发光底物，作用5min后曝光。

1.2.4茜素红染色

收集培养4d，5d，6d诱导与未诱导的细胞，用PBS清洗，加入70％乙醇放入-20℃，1h，三蒸水洗3次，加入10mg/mL的茜素红，作用15min，再用PBS37℃孵育20min。风干后显微镜下观察。

1.3统计学分析

采用SPSS13.0软件对数据进行单因素方差分析,方差分析采用LSD法。

2结果

2.1BMP信号通路中关键分子磷酸化水平的改变

图1BMP2诱导提高了Smad蛋白与p38的磷酸化水平

经BMP2诱导4h与未诱导对照组细胞提取蛋白，Westernblot检测Smad1/5/8及p38磷酸化水平（上图），同时做β-actin内参（下图）。

2.2茜素红染色结果

图2BMP2诱导后C3H10T1/2细胞成骨分化图

对BMP2诱导不同时间（4d,5d,6d）C3H10T1/2细胞进行茜素红染色（上图），同时对未诱导组做对照染色（下图）。

2.3BMP2诱导对成骨相关因子表达水平影响

其结果如表1。结果表明，与未诱导组相比，ALP在3d与6d的表达与对照组相比有统计学意义（P<0.05）。

表1荧光定量PCR检测成骨相关因子表达水平

3讨论

骨的形成是一个多阶段，受多种因素调节的过程。其中BMP2在促进骨形成过程中发挥了极其重要的作用，已被用于临床骨疾病的治疗。

在本项研究中，用BMP2对C3H10T1/2细胞进行诱导，观察细胞成骨情况及成骨转录因子表达水平变化，结果显示C3H10T1/2细胞经BMP2诱导，BMP2信号通路上的关键分子Smad1/5/8及p38磷酸化水平上升，同时茜素红染色显示出C3H10T1/2细胞的成骨分化，说明BMP2对C3H10T1/2细胞的诱导激活了Smad及MAPK通路[6]，并通过信号传导进而激活下游转录因子，促进成骨。

ALP是成骨细胞表型分化标志[7，8]，ALP的mRNA在成骨细胞增殖早期已经出现了转录；增殖后期,其ALP活性可增加2～3倍[9，10],这与本实验定量RT-PCR中其mRNA的表达量持续上升相一致。

本项研究明确了BMP2可以促进C3H10T1/2细胞成骨分化，并阐明了这一促进作用可以通过Smad及MAPK两条通路传导，激活系列成骨转录因子，从而导致C3H10T1/2细胞成骨分化的分子机制。

参考文献

[1]JessicaKopf,AnsgarPetersen，GeorgNDuda，etal.BMP2andmechanicalloadingcooperativelyregulateimmediateearlysignallingeventsintheBMPpathway[J].BMCBiol.2012，10:37.

[2]FuxC,MittaB,KramerBP，etal.Dual-regulatedexpressionofC/EBP-aandBMP-2enablesdifferentialdifferentiationofC2C12cellsintoadipocytesandosteoblasts[J].NucleicAcidsResearch.2004，32(1)：1-9.

[3]MakhijaniNS,BischoffDS,YamaguchiDT.RegulationofProliferationandMigrationinRetinoicAcidTreatedC3H10T1/2CellsbyTGF-bIsoforms[J].JOURNALOFCELLULARPHYSIOLOGY.2005,202(1):304–313.

[4]DateT,DoiguchiY,NobutaM，etal.Bonemorphogeneticprotein-2inducesdifferentiationofmultipotentC3H10T1/2cellsintoosteoblasts,chondrocytes,andadipocytesinvivoandinvitro[J].JOrthopSci.2004,9(5):503–508.

[5]GeigerM,LiRH,FriessW.CollagenspongesforboneregenerationwithrhBMP-2[J].AdvancedDrugDeliveryReviews.2003,55(12):1613–1629.

[6]ChanGK,MiaoD,DeckelbaumR,etal.Parathyroidhormone-relatedpeptideinteractswithbonemorphogeneticprotein2toincreaseosteoblastogenesisanddecreaseadipogenesisinpluripotentC3H10T1/2mesenchymalcells[J].Endocrinology.2003Dec;144(12):5511-20.

[7]ShenZJ,KimSK,JunDY,etal.AntisensetargetingofTGF-β1augmentsBMP-inducedupregulationofosteopontin,typeIcollagenandCbfa1inhumanSaos-2cells[J].experimentalcellresearch.2007,313(7):1415–1425.

[8]HataK,NishimuraR,IkedaF，etal.DifferentialRolesofSmad1andp38KinaseinRegulationofPeroxisomeProliferator-activatingReceptorγduringBoneMorphogeneticProtein2-inducedAdipogenesis[J].MolecularBiologyoftheCell2003.14(2):545–555.

[9]BramonoDS,MuraliS,RaiB,etal.Bonemarrow-derivedheparansulfatepotentiatestheosteogenicactivityofbonemorphogeneticprotein-2(BMP-2)[J].Bone.2012Apr;50(4):954-64.

[10]JangWG,KimEJ,KimDK,etal.BMP2proteinregulatesosteocalcinexpressionviaRunx2-mediatedAtf6genetranscription[J].JBiolChem.2012Jan6;287(2):905-15.