安徽黄山地区肠道病毒71型的基因特征分析

安徽黄山地区肠道病毒71型的基因特征分析

程鹏程韶光

程鹏程韶光

（黄山市疾病控制与预防中心安徽黄山243000）

【摘要】目的：了解2012-2013年黄山地区流行的肠道病毒71型（EV71）基因型情况。方法：利用RT-nPCR检测两年43份临床诊断为手足口病患儿的咽拭子标本。结果：43份标本中检测到13份阳性EV71RNA，检出率为30.23%；经过测序证实13份标本均为EV71C4型。结论：黄山地区2012-2013年手足口病主要由C4型EV71病毒引起且存在很高的同源性。

【关键词】肠道病毒71型手足口病基因型同源性

【中图分类号】R39【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）16-0049-03

TheanalysisofgeniccharacteristicsofEnterovirus71inHuangshanArea

ChengPeng,ChengShaoguang

(HuangshanCenterforDiseaseControlandPrevention,Huangshan243000,China)

【Abstact】ObjectiveInordertoinvestigatetheEV71genotypesinHuangshanarea.MethodsEV71RNAwasdetectedin43HFMDsamplesfromthehospitalsbyreversetranslationpolymerasechainreaction(RT-nPCR).ResultThereare13positiveproducts,positiverateis30.23%；Afterthe13positiveproductsweresequenced,theresultsshowthemallC4genotypeEV71.ConclusionItseemsthattheHFMDchildrenaremainlyinfectedbytheC4genotypeEV71inthisareaandthecurrentCgenotypeEV71didnotvariedsignificantlyinthecity.

【KeyWord】EV71Hand-foot-mouthdiseaseGenotypeHomogeneous

人类肠道病毒71型(EV71)属于肠病毒属A型，是引起手足口病(Hand,footandmouthdisease,HFMD)主要病原体之一，临床症状有疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎及脑炎等。EV71相比于其他手足口病的病原最大的一点区别，是其急性感染易造成严重的神经系统疾病，可引起10%-25%患儿死亡[1]。2008年安徽省阜阳市发生儿童感染EV71疫情，死亡总人数达到36人[2]。

学者利用VP1序列的差异对EV71进行分子流行病学研究发现[2]，EV71可分为A、B、C三个型。各地流行的EV71病毒株存在差异，美国、澳大利亚、以及南美洲流行的毒株为A和B型毒株，1997年以后亚太地区开始EV71的流行，主要为C型[3]，而2008年安徽省阜阳市流行的毒株则为C4亚型。

为了解皖南山区EV71流行毒株的基因型别，我们对2012-2013年黄山地区43例手足口病疑似患儿的咽拭子标本进行EV71RNA检测，对其中的13份RT-nPCR阳性产物进行测序，并与已知的基因型以及亚型代表株进行序列比对，发现本地区EV71感染虽然均为EV71C4型引起，但不同毒株之间存在一定的变异。

1材料与方法

1.1EV71代表株和序列

从GenBank中获取8株EV71的VP1核苷酸序列，其中2株EV71为全基因序列，6株为EV71部分基因序列，包括A、B、C型。

1.2临床标本来源

根据卫生部发布的《手足口病预防控制指南》(2008年版),收集2012年7月至2013年9月安徽黄山地区收治的临床诊断为手足口病患儿的咽拭子标本共43份。

1.3引物的设计

根据GenBank中已知的EV71核苷酸序列，利用不同的基因型以及亚型的保守区合成的一组通用性引物，引物序列为：第一轮:5’-GTTCTTAACTCACATAGCA-3’,5’-CCRGTAGGKGTRCACGCRAC-3’;第二轮:5’-GTTCTTAACTCACATAGCA-3’,5’-TTGACAAAAACTGAGGGGTT-3’。引物位于EV71VP1区域，能有效的扩增EV71A、B、C的基因片段[4]。

1.4RNA抽提及半巢氏RT-PCR检测

取200ul咽拭子按照圆点自动核酸抽提仪器进行病毒RNA的提取。所提取RNA贮于-70℃或立即进行反转录反应。实验设阴性对照，逆转录反应条件为：45℃逆转录60min，94℃预变性5min；第一轮PCR反应条件：94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃再延伸10min。第二轮PCR反应条件:94℃30s,54℃45s,72℃45s,35个循环。

1.5序列的测定和分析

将PCR阳性产物用纯化试剂盒（天根)纯化后进行测序，由上海英骏生物公司完成序列的测定。采用分子生物学软件DNASTAR和MEGA4.1软件包进行序列的同源性比较、遗传距离计算以及基因进化树的绘制，方法参照文献[5]。

2结果

2.1、EV71RNA的检测

应用RT-nPCR的方法，选择EV71不同型的通用性引物对本地区临床诊断为手足口病患儿的43份咽拭子标本进行EV71RNA检测，结果有13份标本阳性，阳性率为30.23%。图1是部分阳性标本PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。

图1黄山地区标本的PCR产物电泳图

1.Marker2.阴性对照3.阳性对照4.HS-01;

2.2同源性分析

将13份阳性标本的PCR产物纯化后测序，并将所获得的核苷酸序列与EV71各基因型的相应区进行段比较（表1）。这13株EV71分离株与A、B基因型代表株比较差异较大，与A型代表株U22521核苷酸序列同源性为77%;与B基因型代表株核苷酸序列同源性为82.9%,与C型代表株具有较高的同源性,为85.6-99.5%，与C4基因亚型同源性最高，达到99.5%。13株内部同源性最高，达到99.5-100%。

表1黄山地区三城市13例EV71毒株间核苷酸同源性的比较（%）

2.3基因分型

从基因进化树(图2)可以看到，EV71A型U22521株构成一个主要分支；U22522，构成另外一个主要分支，为B亚型；而本实验中所得的13例阳性标本与来自阜阳、新加坡、台湾等6株毒株形成一个较大分支，提示这13份标本均属于C型EV71，同时和阜阳EU703812毒株形成同一亚型，为EV71C4。在C型EV71这一主分支中还可以分为5个亚分支，代表5个不同的基因亚型，其中AF135932AB552988和AF1359482例毒株形成一个亚分支，为C2亚型，AY125976形成一个亚分支，为C3亚型；我们分离的33株和阜阳株共同组成一个分支，为C4亚型。

图2基于EV71VP1区域的基因进化树及基因分型

3讨论

1969年美国加利福利亚一名患有中枢神经系统疾病的婴儿首次分离出EV71病毒，随后全球范围内均有EV71流行情况的报道。1998年以来亚太地区手足口病的发病率呈明显上升趋势，日本、我国台湾地区、泰国等地区发生了多次HFMD的大流行，我国深圳、山东地区也多次发生了EV71引起的手足口病的疫情。

由于HFMD主要由EV71和CA16引起，但两者临床症状类似，难以区分，因此主要依靠实验室诊断。目前实验室常规诊断方法主要有病毒分离、免疫组化以及中和抗体的检测。但这些方法费时、费力，不能满足大标本量和快速诊断的要求。研究表明[6]肠道病毒（EV）的血清型与VP1基因序列密切相关，可用于鉴定EV血清型；同时由于其存在最大的变异率，因此研究人员利用这一点对EV病毒进行同源性进化分析和分子流行病学研究。

本研究采用EV71特异性引物，扩增出EV71VP1区232bp的基因片段，从而达到快速诊断的目的。本研究对43份咽拭子标本进行了扩增，其中有13份标本阳性。并对13株病毒的特异性基因片段进行了基因进化分析，结果发现，13株病毒与A、B基因型代表株存在较大差异，而与C型代表株存在较高的的同源性，尤其与属于C4亚型毒株有很高同源性。

以往研究认为各毒株基因型内部的差异大于15%为一个新的基因型，而同源性小于12％为分亚型的标准[7]。我们所分离13株病毒与C型同源性为85.6-99.5%之间，应该没有出现新的型或亚型，从基因树分析也可以看出，所有13株病毒属于C型，以往研究表明所扩增的片段较小易引起较大差异的同源性，但我们结果表明，较短的片段仍然可以用于以往的分型原则。

根据基因同源性的结果，我们发现13株EV71分离株均属于C4亚型，与其他地区所分离毒株同源性不高且存在较大变异的结果不同。因此，对不同地区EV71分子流行病学进行深入的研究有利于我们研制特异性强、灵敏度高的诊断试剂和EV71疫苗。

参考文献

[1]吴康平.EV71感染致手足口病合并中枢系统感染50例临床分析[J].浙江临床医学,2014,2:285-286.

[2]高勇,韩明锋,李秀勇,等.阜阳市2011年手足口病实验室检测结果分析[J].检验医学,2013,28(9):796-800.

[3]翁育伟.肠道病毒71型研究进展[J].中国人兽共患病学报,2014,30(1):79-84.

[4]崔爱利,许文波,李秀珠,等.肠道病毒71型的RT-PCR诊断及基因特征[J].病毒学报,2004,20(2):l60-165.

[5]陈国兵,孟继鸿.戊型肝炎病毒摩洛哥株非编码区基因序列鉴定及基因型分型[J].中华微生物学和免疫学杂志,2004,24(10):828-833.

[6]张颖,和鹏,陈纯,等.广州市2011年柯萨奇病毒A组6型的分子流行病学特征[J].中华流行病学杂志,2014,35(01):103-104.

[7]栾明春,薄志坚,刘丹红,等.大连市肠道病毒71型VP1区段基因特征分析[J].中国卫生检验杂志,2012,22(8):1853-1855.