马鹿茸水溶性总蛋白提取工艺研究

马鹿茸水溶性总蛋白提取工艺研究

周杰

（泸州医学院附属医院中药房四川泸州646000）

【摘要】目的：优选鹿茸水溶性蛋白的最佳提取工艺。方法：以马鹿茸为原料，采用组织匀浆结合浸提的方法提取可溶性蛋白，以鹿茸可溶性蛋白得率和含量为评价指标，通过单因素实验研究匀浆方法、匀浆次数、提取溶液浓度和pH对鹿茸可溶性蛋白得率的影响，优化提取工艺。结果：鹿茸可溶性蛋白的最佳提取工艺为，以pH为7，50mmol•L-1的Tris-HCl缓冲溶液为提取溶剂，采用电动匀浆机，匀浆次数为3次。结论：优化得到的提取工艺稳定、可行，可为进一步研究鹿茸蛋白的药理药效提供参考。

【关键词】鹿茸；水溶性蛋白；提取工艺

【中图分类号】R285.5【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）02-0367-02

OptimizationofExtractionTechnologyofSolubleProteinsfromVelvetAntlerofCervuselaphusLinnaeusZhouJie.

PharmacyofChinesemedicineAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,SichuanChina

【Abstract】ObjectiveTooptimizetheappropriateextractingtechnologyforsolubleproteinsfromvelvetantler.MethodsExtractedthesolubleproteinswithhomogenatemethod,studiedtheeffectofhomogenatemethod,homogenatetimes,concentrationandpHofextractionsolvent,usingsolubleproteinsextractionratesandcontentastheindices.Results:Theoptimalextractiontechnologyforthesolubleproteinswasasfollows:electrichomogenate,theextractionsolventof50mmol•L-1,pHof7.Theextractionrateofhesolubleproteinsfromvelvetantlerwasandthecontentofthesolubleproteinswas.ConclusionTheoptimalextractiontechnologyisstableandfeasible,andcanprovidereferenceforfurtherstudyonvelvetantler.

【Keywords】Velvetantler;Solubleproteins;Extractiontechnology

鹿茸为鹿科动物梅花鹿(CervusnipponTennminck)或马鹿(CervuselaphusLinnaeus)的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，具有壮肾阳，益精血，强筋骨等作用[1]。鹿茸中含多种活性物质，其中鹿茸蛋白占鹿茸总质量的52%以上[2]，现代研究表明，鹿茸蛋白能在多方面调节人体生理功能，对内分泌、免疫、血液系统等均有影响[3-4]。目前对于该成分的提取工艺研究方面，大多采取简单的静置和搅拌方式[5-7]，张梦莹等[8]采用碳酸盐缓冲溶液结合超声波技术提取，Tris-HCl缓冲溶液结合组织破碎的提取方法还未见报道。本研究将Tris-HCl缓冲溶液浸提和组织破碎的提取方法相结合，并优选出较优提取工艺参数，为进一步开发和利用鹿茸这一宝贵资源提供科学依据。

1.仪器与试药

1.1仪器

TU-19系列紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器公司）；Neofuge23R高速冷冻离心机（HealForce公司）；ULT1386-3-V30超低温冰箱（日本三洋电器公司）；pHS-3C型酸度计（上海伟业公司）；电动匀浆器（美的公司）；FSH-2A可调高速匀浆机（江苏金坛市医疗仪器厂）。

1.2实验材料

内蒙古赤峰巴林左旗雄性马鹿鹿茸；采茸方式为全身麻醉消毒锯茸留血密封后冷藏运输，2小时内放置-80℃冷冻保存。

1.3试药与试液

标准牛血清白蛋白（BSA）（北京拜耳迪公司）；考马斯亮蓝试剂（G-250）（北京拜耳迪公司），并参照文献方法配制成溶液[8]；三羟甲基氨基甲烷（Tris，Sigma公司）；其他试剂均为分析纯。

2.方法与结果

2.1蛋白质含量测定方法学的建立

2.1.1对照品溶液制备精密称取牛血清白蛋白1.0mg，用蒸馏水溶解并定容至10mL，配成浓度为0.1mg/mL的牛血清蛋白标准溶液，保存在4℃冰箱中，待用。

2.1.2样品的制备称取鹿茸样品10g，解冻，切薄片，用4℃的蒸馏水冲洗；4℃下，用50mL的Tris-HCl缓冲液（50mmol/L，pH值为7）提取24h；将鹿茸放入匀浆机中匀浆3次，每次10s，每次暂停3s；将渗出液合并残渣在4℃下浸提24h；离心20min（10000r/min，4℃），取上清，得到待测样品。

2.1.3标准曲线的制定分别精密吸取对照品溶液0、100、200、400、600、800、1000μL，于10mL刻度试管中，加入5mL考马斯蓝G-250显色剂，混匀，放置10min，冷却至室温，并同时制备空白溶液，于595nm处测其吸光度，以对照品溶液的含量为横坐标，以吸收度为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为：Y=0.005X+0.046，相关系数r=0.9991，线性范围为10ug～100ug。

2.1.4精密度考察精密吸取对照品溶液800μL，按2.1.3项的方法测定，在595nm波长下，连续测定5次，其RSD值为0.6%，表明仪器精密度符合方法学考察要求。

2.1.5重现性考察分别称取相同质量的5份样品，按2.1.2项下制备样品，按2.1.3项下的方法测定，计算RSD值为2.8%，本方法重现性符合方法学考察要求。

2.1.6显色稳定性考察称取1份样品，按2.1.2项下制备样品，按2.1.3项下的方法测定，在595nm波长处，分别于5、15、25、35、45、55min时，测定吸收值，计算RSD值为1.4%，表明供试品在显色55min内保持稳定。

2.1.7加样回收率实验精密移取已制备的供试品溶液5份，每份0.5mL，分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL的蛋白质标准溶液，按2.1.3项下的方法测定，样品平均回收率为83.3%，RSD为2.1%。

2.2匀浆方法对马鹿茸总蛋白提取率的影响

匀浆是破碎机体软组织最常用的方法之一，它的工作原理是通过固体剪切力破碎组织和细胞，释放蛋白进入溶液。由于匀浆过程中蛋白质被蛋白酶降解的可能性较小，所以匀浆是简便、迅速、风险小的组织破碎方法。本实验比较了FSH-2A可调高速匀浆机和电动匀浆器两者在鹿茸蛋白提取应用中的优劣，结果见表1。表明FSH-2A可调匀浆机处理鹿茸样品的蛋白提取率更高，但每次处理量少，需要时间更长。

2.3匀浆次数对马鹿茸总蛋白提取率的影响

考察匀浆次数分别为1、2、3、4、5次对马鹿茸总蛋白提取率的影响，以匀浆次数为横坐标，以蛋白提取率为纵坐标，结果见图1。随着匀浆次数的增加，总蛋白提取率增高，匀浆次数超过3时，蛋白提取率增高的趋势放缓，为了减少蛋白质变性及提取时间，确定匀浆次数为3次。

3.讨论

本实验考察了FSH-2A可调高速匀浆机与电动匀浆机对鹿茸水溶性总蛋白提取率的影响，从实验结果看出FSH-2A可调高速匀浆机蛋白得率较高，但每次处理量少，适合实验室研究，在大工业大生产中，电动匀浆机更方便、处理样品更多、更节约时间。

本实验对匀浆次数、提取液离子强度和pH值进行了单因素考察，确定了马鹿茸水溶性蛋白的最佳提取条件为：电动匀浆机匀浆3次，Tris-HCl浓度为50mmol•L-1，pH值为7。

由于鹿茸不同分叉、不同部位所含的蛋白成分和含量可能不同，为了减少由此带来的干扰，本实验都选取具有两个分枝的马鹿茸，从分枝顶端开始截取10cm进行切片、混匀，称取10g进行样品制备。

本实验对匀浆方法、匀浆次数、缓冲液浓度和pH值进行了单因素考察，但为了进一步优化工艺，还应采取单因素或正交试验法对浸提时间、料液比等条件进行全面的考察。

【参考文献】

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版：1部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：303.

[2]佟鑫，刘玉侠，吴荻等.鹿茸多肽组分药理作用的研究进展[J].中国医药技术经济与管理，2009，3（4）：60-62.

[3]刘瑜，王振宇，周丽萍.鹿茸提取物对糖尿病小鼠血糖及衰老的影响[J].东北林业大学学报，2010，38（5）：97-98，113.

[4]ZhaoL，LuoYC，WangCT，etal.Antioxidantactivityofproteinhydrolysatesextractofvelvetantle（Cervuselaphus）asmolecularweightandenzymes[J].NaturalProductCommunications，2011（6）：1683-1688.

[5]岳喜庆，徐明，王澜儒.响应曲面法优化鹿茸蛋白提取条件[J].食品研究与开发，2011，32（9）:59-62.

[6]赵大玮，李丹，陈智嘉等.吉林省双阳梅花鹿鹿茸水溶性蛋白组分的提取及对小鼠主要脏器病理形态学的影响[J].吉林大学学报：医学版，2011,37（3）:448-451.

[7]HainesSR．Lowmolecularweightextractionprocess:US，7547761B2［P］.2009-06-16．

[8]张梦莹，赵玉娟，李倩竹，等.梅花鹿茸可溶性蛋白提取工艺及免疫活性[J].东北林业大学学报，2014，42（9）：158-163