解析采供血机构检验科酶联免疫试验（ELISA）的异常现象

解析采供血机构检验科酶联免疫试验（ELISA）的异常现象

程文娟1杨茹2

程文娟1杨茹2（通讯作者）

（武汉血液中心检验科湖北武汉430030）

【摘要】酶联免疫试验是目前国内采供血机构筛查四项传染性指标的主要方法，保障其结果的准确性至关重要。本文从试验中断、白板、花板、结果呈负值及非特异性显色五个方面分析了它们产生的原因，并进一步探讨了如何减少这些异常现象的发生，旨在提高ELISA筛查血液传染性指标的准确性，确保临床用血安全。

【关键词】ELISA试验中断白板花板负值非特异性显色

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）18-0085-02

采供血机构的血液筛查同临床医院检验及科研工作中的检验有本质的不同，具有特殊性：一方面，血站每天大规模检测血液，但其检测的项目和检测的方法有限；另一方面，血液筛查的结果一旦判定，血液发放至临床，将再没有机会更正，一旦发生错误，后果非常严重，关系到献血员的健康和受血者的生命。目前，酶联免疫试验(ELISA)是国内血站检验科筛检四项传染性指标的主要手段，保障其结果的准确性至关重要。但在日常ELISA试验中，经常会遇到各种异常情况。正确处理各种异常情况，深入了解其产生的原因及制定相应的处理措施在保障血液安全中具有举足轻重的作用。本文将日常ELISA试验中遇到的异常现象逐个分析，希望能对同行有所帮助。

一、试验过程中断

这在日常工作中发生较为普遍，经总结，大致有以下几种情况：

1.试剂条形码不能被识别，试剂槽从4℃冰箱取出后平衡至室温过程中,试剂槽外条形码上容易凝结水珠,以致FAME不能读取试剂而将板吐出[1]。另外，当日工作量超过10架标本时，往往需要在10架以后，指定并更换试剂槽的条码，若指定错误或未及时更换，也会发生吐板。因此，放置试剂槽前应用吸水纸将条形码拭干后再放入，且密切关注试验过程，及时更换条形码。

2.工作表编制不合理，导致孵育超限。这在试验中断中占有较高的比例。多数是因为过于紧凑的编制工作表或仪器正在运行中，频繁的变更工作表所致。

因此，合理的编制工作表，尽量缩短仪器的负值宽容度，让仪器在较为宽松的时间条件下运行和形成不允许工作表运行过程中轻易变更工作表的规章制度都至关重要。

3.试剂的量不足，试剂槽内试剂的量达不到试验需要量,以致FAME无法加试剂而将板吐出。每日工作前，应保证试剂槽内试剂的量稍多于提示的试剂需要量,一般为多出2ml。

4.条码粘贴问题：正确的粘贴条码非常重要。若条码粘贴位置偏高，仪器无法读取条码而无法进板。条码粘贴位置偏低，则会与仪器粘连而吐板。若条码贴混，比如丙肝的条码帖在乙肝的微板上，这样FAME也会无法识别。

5.试剂槽内有气泡:倒试剂时过急过快，摇晃试剂槽，都可能导致试剂槽内产生气泡[1]，容易使FAME无法感应而吐板。

6.微板不平整:试验前应将微板按压平整。

7.洗液桶感应不好或未及时更换洗液桶。每次试验时应检查各个项目的洗液是否都正确的感应了。如果没感应到，工作表中洗液所在的通道位置栏会显示为灰色。感应头出了故障，各通道扫描时出现错误等都会导致感应失败。有时标本量较大，需在试验过程中更换洗液桶，若更换不及时，也会导致试验中断。

8.注液针堵塞:标本有凝块,管路有异物，洗液有结晶，都会引起洗板头堵塞。因此，应避免标本内出现凝块,有结晶应待其融解后再配置洗液。每次试验完毕使用专用清洗液冲洗管路,保持管路畅通。严格规范FAME的维护保养，做好日、周、月三步维护。若注液针已堵塞，应取出洗板头，用专用的清理针进行清理，同时用蒸馏水冲洗，将堵塞物排除。管路堵塞时应通知工程师及时处理。

9.注射器损坏：日常工作中倒试剂前，都会甩干试剂槽的残余液体及排净注射器内的微量液体。来回的抽吸易导致注射器损坏。因此，注射器使用三个月左右后，应注意更换。

10.机械故障:偶尔仪器因各种原因出现死机、微板的四个托架脚脱落、传输架冲撞、程序丢步等现象，因每台仪器的使用不同而出现不同的情况，出现此种情况，应及时通知工程师进行维修。

二、白板

这种情况多数系人为的原因造成，总结各种情况如下表所示。

三、花板

花板在试验中也偶有发生，究其原因，总结如下：

1.洗板机维护或洗液的配置不当：洗液桶内有异物、注液针堵塞，废液桶已满导致使用时洗液回流，洗液浓度偏低，洗液量不够使得洗板不充分等都是花板的主要原因。因此，日常工作中应注意洗液桶的清洁问题,配置洗液严格按照试剂说明书要求，保证洗液充足。为避免长菌,必须及时倒空洗液桶内未用完的洗液（一般国产试剂的洗液需当天倒空，进口试剂的洗液当天用完需放入4℃冰箱，每隔三天倒空）。洗板头如出现漏水或不出水现象,应立刻停止使用，及时通知工程师。定期维护洗板机。洗站应尽量保持干燥,特别在关机后,必须用抹布抹干上面的水渍。定期对管路系统进行拆洗,用消毒液对单向阀、桶内塑料软管、洗液滤网、内壁彻底清洗,防止因压力不足导致洗液量不够[2]。

2.洗板机编制的程序问题：如洗涤次数偏少、注液量偏多、注水力较大等。每个程序投入使用前应做好确认，一经确认可行，一般工作人员无权更改。确保试验的准确性。

3.手工操作细节问题：比如因一次性试验微板中断较多，导致有的微板显色时间或孵育时间较长。手工洗板后扣板不充分，拍过加酶的微板后的滤纸反复使用等，具体情况因人而异。应尽量避免这些情况发生，规范试验步骤，多在细节上下功夫。

4.试剂质量问题：如试剂变质，尤其是底物变质、底物接触了金属器械或底物混合后放置时间较长，未避光保存、加底物或酶的试剂槽被污染等。

5.标本处理不当：应正确处理标本，防止大规模溶血、血浆层异物、尽量使用一次性加样针，防止交叉污染。

四、负值

有整板结果OD值均呈负数、大部分阴性结果OD值呈负数、偶尔几孔或几排的OD值呈负数以及固定位置的一排或几排的OD值呈负数这四种现象。其产生的原因大致如下：

1.酶标仪编程采用了双波长+“空白调0”的方式。原则上采取双波长检测时不要再设置“空白调0”，单波长检测时才进行“空白调0”设置。仪器在处理、计算结果时，主测定波长OD值减去空白对照的OD值后，还要减去参照波长的OD值。因此，当底板干净而OD值较低时，双波长再设置“空白调0”，容易出现负值。

2.终止液未达到要求的浓度。在450nm测量波长下，终止颜色的深浅与被检测物质的浓度和被吸收的量（OD值）成定量关系。当终止不彻底时，反应颜色未完全转变。因此，结果会不准确。有时会出现OD值负值现象。

3.终止后各孔液面高度不一样。这主要是检测液体的量不准确造成。主波长与参考波长反射光与折射位点不一致，从而导致OD值呈负数。

4.参考波长的滤光片有划痕或异物遮挡。主要表现为部分阴性结果固定位置规律性地呈现负值。应通知工程师定期擦拭滤光片。

5.酶标板底部有划痕或异物粘附。常常表现为一过性OD值负值现象。

6.编辑的计算方法有误。排除以上原因后，负值现象仍不能消除，应考虑编辑的计算公式或阴、阳对照及质控的位置与微板实际是否存在出入[3]。

一旦出现上述情况，应认真查找原因。确保终止液加样准确，及时检查和更换滤光片，定期做维护和校准。并注意实验室温度和湿度及保持清洁。当负值较小且质控数据在控时，不会影响ELISA实验的定性检测，实验结果有效。当负值较大，不管质控对照孔是否在控，结果均应视为无效，并及时将微板拿到其它正常酶标仪上进行判读，以免影响试验的准确性。

五、读板正常，但假阳性偏多，与对侧试剂或复检结果或肉眼观测明显不符

产生假阳性的因素有很多，包括抗原的纯度、包被的浓度、内、外源性干扰物的影响、加样、洗涤、温育等任何一个步骤的失误都将导致非特异性显色。比如，就加样过程的操作来说，以下四种情况即可导致非特异性显色[6]。

1.加样太快，有些标本加在孔壁上部的非包被区，导致了非特异吸附。

2.加样溅出对邻近孔产生了污染。

3.孔内有污染杂物，记得实验前检查各孔，并倒扣着拍几下。

4.拖带。

洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但决定试验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到将非特异性吸附的干扰物质分离的目的。洗板过程中，浸泡时间太长或太短都有可能导致结果不准确。洗板后，孔内残余液体的量也会影响结果。微板放入温育箱温育时，若不盖上封板膜，有可能试剂会蒸发而导致假阳性。若叠放，则容易导致边缘效应[4]。温育时间偏长或者温度偏高，也容易导致假阳性。加终止液时若产生气泡，读板时也可能出现假阳性结果，这种情况下肉眼能分辨，必须重新读板。当然，ELISA试验自身也有一定的局限性，难免会出现假阳性。对于我们检验工作者来说，初次ELISA检测呈反应性的标本，必须做好复检试验。仔细分析试验结果，多与同一项目的对侧试剂核对。一块微板上若出现大规模的假阳性，即为花板了，试验无效，必须重做。

参考文献

[1]沈秀芬，李江.瑞士HamiltonFAME全自动酶联免疫分析系统使用中的常见故障及处理.检验医学与临床,2012,9(20):2652-2653.

[2]张生吉.ELISA试验“花板"现象探讨.中国现代实用医学杂志，2008,7(5):763.

[3]刘海涛，王明月.酶标仪双波长比色出现负值原因分析及解决方案.中国输血杂志,2011.4(1):64-65.

[4]李金明.如何正确的进行ELISA测定操作.检验诊断与实验室自动化，2004，45.