对荧光法同型半胱氨酸测定试剂盒进行初步临床应用评价

对荧光法同型半胱氨酸测定试剂盒进行初步临床应用评价

孙桂军

孙桂军（山东省新汶矿业集团莱芜中心医院检验科271103）

【摘要】目的通过对荧光法同型半胱氨酸（Hcy）测定试剂盒各种性能的测定，对荧光法测定Hcy的可靠性进行评价。方法用荧光法同型半胱氨酸测定试剂盒对采集的样本进行Hcy的测定，对其精密度水平、线性范围以及抗干扰性能做出评价。结果通过荧光法测定Hcy的精密度<5%,可满足临床需求；在0～50.0μmol/L范围内，线性良好，r=0.9960；胆红素、甘油三酯、抗坏血酸和血红蛋白对该试剂盒的测定结果无明显干扰，P>0.05。结论荧光法同型半胱氨酸测定试剂盒各项性能较好，能够满足临床检测的需求，值得广泛推广。

【关键词】荧光法同型半胱氨酸试剂盒应用评价

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）13-0121-02

目前临床医生对于同型半胱氨酸的测定以及正常限定值还缺乏统一的全面的认识，目前测定同型半胱氨酸的方法主要有高效液相色谱(highperformanceliquidchromatographyHPLC)，酶联免疫吸附测定法(ELISA)，荧光偏振免疫法(fluorescencepolarizationimmunoassayFP-LA)，循环酶法等多种方法[1-2]，但由于仪器昂贵、操作繁琐等因素均难以普及推广，本文通过探究荧光法同型半胱氨酸测定试剂盒的各项性能指标，希望为临床同型半胱氨酸的测定另辟蹊径，现报道如下：

1.资料与方法

1.1一般资料

本实验采用荧光法测定同型半胱氨酸试剂盒测定同型半胱氨酸，所用材料如下，包括：同型半胱氨酸（tHcy）荧光法定量测定试剂盒，型号：HCY-01，规格：100人份/盒，生产厂家：济南杏恩生物科技有限公司；P-162微量荧光检测仪，产品标准：YZ/苏0588-2003OP-16系列微量荧光检测仪，生产批号：苏药管械(试)字2004第2060240号，生产厂家：无锡市欧普兰科技有限公司；精密度检测采用的是低浓度水平(10.0μmol/LHcy)和高浓度水平（20.0μmol/LHcy)的配套质控物，由济南杏恩生物科技有限公司生产；线性范围测定采用的是不同浓度水平的定值Hcy血清，其浓度水平包括：0μmol/L、10.0μmol/L、20.0μmol/L、30.0μmol/L、40.0μmol/L、50.0μmol/L，定值Hcy血清由用sigma公司提供；抗干扰实验采用的是10.0μmol/L的定值Hcy血清和干扰物混合配制而成的样本，干扰物包括胆红素（200mg/L）、甘油三酯（0.5%）、抗坏血酸（300mg/L）和血红蛋白（1.5g/L），定值Hcy血清和干扰物均由sigma公司生产。

1.2实验方法

1.2.1精密度的检测

用与荧光法测定同型半胱氨酸试剂盒配套的高低浓度水平的质控物进行测定，分别进行高浓度水平Hcy和低浓度水平Hcy的测定，每天测定三次，连续测量30天，记录测量结果，计算测定值的平均值和方差，用变异系数来表示测定结果的精密度，分别计算批内精密度和总精密度[3]。

1.2.2线性范围的测定

将0μmol/L、10.0μmol/L、20.0μmol/L、30.0μmol/L、40.0μmol/L、50.0μmol/L浓度水平的定值Hcy血清作为理论值，再用荧光法对不同浓度的血清Hcy进行测定，每个样本测定三次，取测量结果的平均值作为测定值，用来与理论值进行线性回归分析[4]。

1.2.3抗干扰实验的测定

用荧光法测定10.0μmol/L的定值Hcy血清，重复测量五次，计算平均值和方差，作为对照组；然后用10.0μmol/L的定值Hcy血清分别与不同干扰物胆红素（200mg/L）、甘油三酯（0.5%）、抗坏血酸（300mg/L）和血红蛋白（1.5g/L）进行混合，配制成四种混合溶液，用荧光法测定同型半胱氨酸试剂盒进行测定，每个样本测定五次，记录数据，计算每组的平均值和方差，与对照组进行比较[5]。

1.3疗效评价标准

本实验的性能评价标准是根据EP5-A(临床化学设备操作精密度评价核准指南)、EP6-A(定量分析方法的线性评价核准指南)以及EP7-A(临床化学干扰试验核准指南)而制定的相关标准，上述相关实验评价核准指南均由美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)须颁发[6]。

1.4统计学方法

应用SPSSl9.0软件分析，计量数据采用均数±标准差(X±S)表示，组间比较采用t检验；线性范围采用线性回归分析方法进行统计分析。

2.结果

根据NCCLS颁布的EP5-A(临床化学设备操作精密度评价核准指南)可以分别对荧光法测定同型半胱氨酸试剂盒的测定结果进行批内精密度、批间精密度、日间精密度以及总精密度的相关计算，本实验选取了较为常用的批内精密度和总精密度作为评价指标，结果见表1、2。

表1荧光法测定同型半胱氨酸试剂盒精密度检测结果

3.讨论

同型半胱氨酸(Hcy)是一种含有巯基的氨基酸，是蛋氨酸在体内代谢的中间产物。其在体内的分解代谢的过程和速率主要受两方面因素的影响，一是遗传因素，主要表现为缺乏分解代谢同型半胱氨酸的某些必要生物酶，从而使得机体代谢同型半胱氨酸的水平较低，另一个主要因素就是机体营养状态，叶酸、维生素B6、维生素B12等营养素在同型半胱氨酸的代谢中起到重要作用，若人体缺乏这些必需的营养素将会影响同型半胱氨酸进一步转化为其他代谢产物[7]。

血清同型半胱氨酸在人体内主要以还原型、氧化型、同型半胱氨酸-半胱氨酸和同型半胱氨酸-胱氨酸二硫化物混合氧化型等形式存在，其中约有80%的同型半胱氨酸通过二硫键与其他蛋白质结合，只有约20%的游离型同型半胱氨酸参与到血循环中去。而有研究显示，同型半胱氨酸的游离态和结合态的比例不是固定不变的，而是随着机体内环境的改变而发生一定的变化[8]。近些年的研究显示同型半胱氨酸是一种能反应血管损伤的氨基酸，其在心脑血管疾病、糖尿病、尿毒症等严重疾病的患者血浆内都有不同程度的升高，现已被认为是心血管、脑血管以及外周血管疾患的独立危险因素，所以临床检测同型半胱氨酸将对疾病的预防和诊断具有重要的意义。现在有些学者认为成人血清同型半胱氨酸水平正常值为4～15μmol/L，理想值为＜12μmol/L，高于15μmol/L可被认为是高同型半胱氨酸血症；老年人（≥60岁）血清同型半胱氨酸水平正常值为15～20μmol/L，高于20μmol/L可被认为是高同型半胱氨酸败血症，但是就目前来看临床医生对于同型半胱氨酸的测定以及正常限定值还缺乏统一的全面的认识[9]。

目前测定同型半胱氨酸的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)，酶联免疫吸附测定法(ELISA)，荧光偏振免疫法(FP-LA)，循环酶法等多种方法，其中主要以高效液相色谱法为首选防范，但由于仪器昂贵、操作繁琐、技术难度较高等因素难以普及推广，本文探究的荧光法同型半胱氨酸测定试剂盒是一项相对来说廉价且操作方便的检测方法。其主要原理是氧化型同型半胱氨酸与二硫苏糖醇(DTT)发生还原反应后再在基因重组酶的作用下分解为相关产物，然后与荧光剂发生反应，形成可定量测量的荧光物质，该试剂盒专用于OP-162微量荧光检测仪检测，OP-162微量荧光检测仪采用荧光散射比较分析法，其激发主波长：650nm，发射主波长：710nm，测试范围：0-100umol/l，当试剂盒中的荧光物质在特定的滤光片主波长650nm激发后可在710nm出发出荧光，从而进行定量的检测[10]。

笔者通过对荧光法测定同型半胱氨酸试剂盒检测结果的精密度、线性范围和抗干扰性能的测定，实验结果说明，荧光法测定同型半胱氨酸试剂盒的各项性能指标均较好。

综上所述，荧光法测定同型半胱氨酸试剂盒用于临床测定同型半胱氨酸具有较高的性能比，其价格便宜，操作方便，适宜临床推广。

参考文献

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[10]邵坤宁，杨丽娟，张海.荧光法测定同型半胱氨酸的方法学评价[J].现代检验医学杂志，2011，26（4）：103～107.