愈疡胶囊对金黄色葡萄球菌抑菌作用的研究

愈疡胶囊对金黄色葡萄球菌抑菌作用的研究

罗伦才贾镕李泰忠李列平童妍王利平

1.凉山彝族自治州第二人民医院四川西昌615000；

2.凉山彝族自治州食品药品监督管理局四川西昌615000；

2.西南交通大学四川成都610031

【摘要】目的：研究愈疡胶囊对金黄色葡萄球菌的抑菌作用。方法：分别采用杯碟法和大鼠烫伤并感染金黄色葡萄球菌（ACTT25923）模型，观察愈疡胶囊对金黄色葡萄球菌的体内外抑菌作用。结果：在杯碟法实验中，通过药物组与对照组抑菌圈直径大小的比较，发现高剂量组抑菌圈直径（1.3125±0.0250cm）明显大于对照组（0.6±0.0086cm），差异有显著性（P＜0.01），根据药物浓度与抑菌圈比值所作的曲线图，愈疡胶囊的最佳抑菌药效浓度为0.175g/ml。在体内抗菌实验中，愈疡胶囊能明显促进大鼠伤口愈合，且随着药物浓度的增加，伤口愈合情况明显加快，愈疡胶囊组单位组织中所含细菌数逐渐减少，高剂量组菌落数（56个）明显低于模型对照组（214个）（P＜0.01）；愈疡胶囊对金黄色葡萄球菌抑菌作用显著。结论：愈疡胶囊对金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌作用，临床可用于治疗金黄色葡萄球菌感染患者。

【关键词】愈疡胶囊；金黄色葡萄球菌；抑菌作用Liangshanyiautonomousprefecture

【中图分类号】R378.1+1【文献标识码】B【文章编号】1674-8999（2015）6-0117-03

愈疡胶囊系四川省凉山彝族自治州第二人民医院生产的中药复方制剂，由山药、蜂蜡等药味组成。具有生肌、敛疮、散结、止痛作用,用于溃疡性口腔炎及乳腺增生症等。此外临床应用还发现其对骨髓炎、蜂窝组织炎、化脓性中耳炎、鼻窦炎、术后感染、窦道、瘘管、肛周脓肿等外科感染性疾病具有显著疗效，具有抗菌消炎等作用。本实验按SFDA的要求[1.2]，选择杯碟法、炎证动物模型、体内外抑菌试验、最佳抑菌浓度等评价愈疡胶囊对金黄色葡萄菌的抑菌作用，为其临床应用和进一步的研究提供实验依据。

1材料

1.1动物

SD雄性大鼠50只，体重200±20g，清洁动物，检疫合格，由简阳达硕动物科技有限公司提供，合格证号：SCXK(川)2013-24。

1.2仪器与试剂

手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器YX280A，上海三申医疗器械有限公司；电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司，BS224S，d=0.0001g；电热恒温培养箱，上海善志仪器设备有限公司，SPX-250；水浴恒温振荡器，常州菲普实验仪器厂，HTZ-82A；无菌操作台，西南交通大学6527实验室；牛津杯；十六号灌胃针等。

胰蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司，生物试剂BR，20120129；牛肉浸膏，成都长寿生物制剂有限公司，生物试剂BR，20120309；琼脂粉，成都市科龙化工试剂厂，生化试剂BR，20101110；氯化钠，成都市科龙化工试剂厂，分析纯AR，20100927；氢氧化钠，成都市科龙化工试剂厂，分析纯AR，20101108；乙醇，成都市科龙化工试剂厂，分析纯AR，2014022201；金黄色葡萄球菌溶液（ACTT25923），浓度2.5×106个/ml等。

1.3药品

愈疡胶囊（1g药粉相当于原生药1.5g），规格：每粒装0.45g；批号：130528；批准文号：川药制字Z20080094；用法用量：口服，一次1-2粒，一日3次，饭后口服，由四川凉山彝族自治州第二人民医院提供。阿莫西林胶囊，中诺药业有限公司，国药准字：H13021770。

2方法

2.1体外抑菌实验

采用杯碟法（抗生素效价测定的生物学定量方法之一），对不同浓度梯度的愈疡胶囊分别进行抑菌实验，每组设立3个平行。对金黄色葡萄球菌进行单克隆菌落挑取，经摇床培养后得到菌悬液，将菌悬液加入牛肉膏蛋白胨培养基中，使菌体固定在培养基内。把灭菌后的愈疡胶囊药粉按1:20，2:20，3:20，4:20，5:20的比例，分别精密称定，用10%乙醇溶液制成20ml药粉悬浊液，取此液加入放置于培养基上的牛津杯至满，37℃正置培养36h后测定抑菌圈直径。以10%乙醇作为空白对照组，比较实验组与空白对照组抑菌圈直径，并根据其比值与药物浓度的关系绘制曲线，从而得到最佳抑菌浓度。

2.2体内抑菌实验

2.2.1大鼠炎症模型的建立

大鼠按体重随机分为模型对照组、阳性对照组和愈疡胶囊高、中、低剂量组5组。阳性对照组用阿莫西林，模型对照组用生理盐水。10%水合氯醛2mL腹腔注射，麻醉大鼠，剪去大鼠腹毛，剃去毛根，用加热砝码烫伤无毛部位，伤处涂抹1ml金黄色葡萄球菌溶液，待其自然均匀分布，即可作为炎症模型。

2.2.2给药方式

灌胃给药。治疗组用愈疡胶囊高剂量630mg/kg，中剂量315mg/kg，低剂量157.5mg/kg，阳性对照组用阿莫西林125mg/kg，模型对照组用生理盐水生1ml/100g。每天给药一次，连续七天。

2.2.3观察指标

从给药第2天开始，观察记录模型动物一般体征、积脓、红肿、溃疡等表现，并分级评分，统计学分析。

停止给药后处死动物，分为A、B、C、D、E五组，每组10只，取皮肤组织，标本按病理检验SOP程序进行脱水、修剪、包埋、切片、HE染色、封片等处理后镜检。于显微镜下观察溃疡、炎细胞浸润、成纤维细胞增生等炎症表现。皮肤组织病变分级标准见表1。

另10只大鼠，在无菌条件下各取愈伤感染组织1g左右，加入4ml0.85%无菌生理盐水匀浆，取匀浆上清液标记为原浓度，以10-1梯度稀释，标记浓度为10-1,10-2,10-3，分别取200ul上清液，涂布于肉汤培养基上，37℃恒温倒置培养16h，选取菌落分散且数量合适的平板，进行计数。依据下列公式计算大鼠愈伤组织的细菌数：

细菌数（个/g）=平板均菌落数*（组织重量g+4）*稀释倍数/(0.2*组织重量g)

3实验结果

3.1体外抑菌实验结果

3.1.1空白对照组与不同药物浓度抑菌圈直径统计结果

空白组采用10%乙醇溶剂作为对照，10%乙醇具有一定的抑菌效果，但仅限于乙醇接触区域，且透明圈（抑菌圈）一致为牛津杯内径0.6cm，以此作为对照。以0.05g/ml为梯度，设立0.05g/ml~0.25g/ml5个药物浓度组，进行实验，对各组抑菌圈直径大小进行计数统计。空白组与各药物浓度组抑菌圈直径大小统计结果如表2。

由以上结果可知，随着药物浓度的增大，在一定范围内，抑菌效果显著增加。但是，在超过0.15g/ml时，药物增加对抑菌效果的影响逐渐减小并趋于平稳，且实验效果在三组平行中均呈现上述趋势。三组平行RSD在0.38-0.58%之间，远低于3%，表明该实验结果具有较好的稳定性和较高的可信度。通过药物浓度与抑菌圈比值所作的曲线图，得到愈疡胶囊最佳抑菌药效浓度为0.175g/ml。

3.2体内抑菌结果

3.2.1肉眼观察结果

给药后第七天：通过肉眼观察，结合各组图片对比，发现模型组大鼠溃疡严重，部分大鼠伤口溃烂并有脓血或红肿现象，红肿部分似血泡；阳性对照组少量大鼠伤口结痂，部分还有红肿现象；愈疡胶囊高剂量大多数大鼠伤口愈合情况良好，并已结痂，并且部分伤口周围已有新增的组织；愈疡胶囊中剂量组大鼠伤口也大部分愈合，伤口部分结痂，并且部分伤口周围已有新增的组织；愈疡胶囊低剂量组有轻微的红肿，少量积浓象。实验结果表明：愈疡胶囊高剂量组相对于模型组效果良好。各组结果见图2-1~5.

3.2.2菌落计数结果

平板菌落计数法：无菌条件下采取大鼠愈伤感染组织1g左右，加入4ml0.85%无菌生理盐水匀浆，取匀浆上清液标记为原浓度，以10-1梯度稀释，标记浓度为10-1,10-2,10-3，分别取200ul上清液，涂布于肉汤培养基上，恒温箱37℃倒置培养16h，取出后，选取菌落分散，且数量合适的平板进行计数，依据下列公式计算出小鼠愈伤组织的细菌数。菌落计数结果表3.

细菌数（个/g）=平板均菌落数*（组织重量g+4）*稀释倍数/(0.2*组织重量g)

5.愈疡胶囊低剂量组

由表3可见，金黄色葡萄球菌模型组细菌最多，实验组在相同稀释倍数下，高剂量愈疡胶囊里含有的细菌数目最少，表现出抗生素样作用。

3.2.3大鼠组织病理形态学镜检结果

A组为模型组（6个3分，4个2分）：表皮缺失，皮下组织坏死、红染，组织结构不清，皮下血管显著充血、水肿伴炎细胞浸润，皮下组织疏松、水肿、增宽，结缔组织溶解，残留组织形成网状结构，多量嗜中性、嗜酸性粒细胞浸润，坏死区域较大；

B组为阳性对照组(3个3分，2个2分，5个1分)：较A组病不略轻，肉芽组织形成区域较大，大部分动物皮肤组织感染较轻，皮下在清除一些坏死脱离的物质及炎性残物；

C组为愈疡胶囊高剂量组（1个3分,3个2分，6个1分）：新生肉芽组织向表面生长，吞噬、溶解、消化、替代、清除坏死组织，向表面推进，大量创伤被结缔组织填充，切割伤口坏死边缘填平，残存有未完全修复创面，感染得到控制；

D组为愈疡胶囊中剂量组（8个2分，2个1分）病理情况基本同A组；

E组为愈疡胶囊低剂量组（1个3分，5个2分，4个1分）病理情况基本同A组。

各组病理显微图片：

结果显示，愈疡胶囊对金黄色葡萄球菌有抑制作用，结合评分进行分析，愈疡胶囊高剂量对金黄色葡萄球菌的抑制作用和其它组比较有显著性差异。

4讨论

众所周知，抗生素在治疗细菌感染中具有不可挑剔的地位。然而近年来，由于抗生素大范围不合理使用，导致医院感染率上升，细菌耐药增加，新抗生素的研究又困难重重，如何治疗由细菌感染所引发的疾病成为摆在人类面前的重要难题[3]。有资料显示，我国临床各类患者70%以上使用抗生素治疗，外科患者使用率竟达90%以上，其中有一半以上的抗生素被用作预防感染，这样反而会导致更快的抗生素耐药性[4]。另外，抗生素在畜牧业和农业中也存在着非常严重的滥用情况，每年大约有1000吨左右的金霉素和6000吨左右的土霉素被用来养殖动物，从最初的农药演变到使用各类抗生素和杀虫剂，使得各类蔬菜、农作物中的抗生素含量大大超标，这样最终也会导致整个人类在不知情的情况下抗生素含量超标[5]，中国已成为世界上产生细菌耐药现象最严重的国家之一[6]，2011年世界卫生组织(WHO)向全球发出呼吁:“抵御耐药性———今天不采取行动，明天就无药可用”[7]。

金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性球菌，对环境条件有很强的适应能力，拥有十分强的毒性，能够使人体皮肤软组织感染、肺炎、手术部位感染等[8]。是常见的致病和引起食物中毒的致病菌之一。

植物是生物活性化合物的天然宝库，它们的次生代谢产物就超过40万种[9]，且植物源抗菌剂具有低毒或无毒、无污染、不易产生抗药性、高效、选择性高的优点[10]，从中寻找“中药抗生素”，成为人们关注的热点。

临床上愈疡胶囊用于治疗骨髓炎、蜂窝组织炎、化脓性中耳炎、鼻窦炎、术后感染、窦道、瘘管、肛周脓肿等，效果良好。本实验对其固定浓度下抑菌圈直径的大小、炎症动物模型伤口愈合情况、愈伤组织菌落数和愈伤组织病理形态等体内外药效学进行了研究，结果提示，愈疡胶囊具有较强的抑制金黄色葡萄球菌抑菌作用，为临床合理应用、后续开发和深层次抑菌机理研究提供了科学数据。前期实验研究还表明，愈疡胶囊具有调整大鼠体内的激素分泌水平[11]，增强正常小鼠细胞免疫功能[12]等多方面的作用，与作用单一的西药抗感染剂不同，其对感染性疾患的疗效是综合作用即多种生理效应强化对细菌的抑制和杀灭作用的结果，或许正是这种综合作用，使其显示出了良好的临床疗效[13]。

参考文献

[1]国家食品药品监督管理局，药品注册管理办法［S］.2002

[2]国家药品监督管理局，中药新药研究的技术要求［S］.1999

[3]杨朝生，陈一强.金黄色葡萄球菌的蛋白质组学研究进展［J］.国际检验医学杂志，2009，30（3）：257-259.

[4]马越．合理利用抗生素，遏制细菌耐药性蔓延［J］．中国药房，2011，22(26):2401．

[5]BinhAnDiepandMichaelOtto．TheroleofvinllelR3edeterminantsinconmmnity-associatedMRSApathogenesis[J]．TrendsinMicrobiology，2008，z6（8），361．

[6]肖永红，侯芳，王进等．抗菌药物不良反应的社会与经济后果调查［J］.中国卫生经济，2010，5(29):94－96．

[7]郑英丽，周子君．抗生素滥用的根源、危害及合理使用的策略［J］．医院管理论坛，2007，1(123):23－27．

[8]范国萍,陈金云,李珺等.金黄色葡萄球菌的分布及耐药性分析［J］．浙江临床医学，2014，16（2）：300-301.

[9]SwainT.Secondarycompoundsasprotectiveagents[J].AmRevPlantPhysiol,1977,28:479-501．

[10]苏学友，李疆，师光禄等．核桃青皮提取物对6种植物病原真菌的抑茵活性研究[J].北京农学院学报，2008，23(1)：42-44．

[11]罗伦才，黄兰雅，季小平等.愈疡胶囊对乳腺增生大鼠雌激素影响的实验研究.中国药业，2011，20（13）：5-6.

[12]罗伦才，季小平，张仲林等.愈疡胶囊对正常小鼠外周血和脾T淋巴细胞亚群的影响.中国药师，2010,13（6）：790-792.

[13]张正和，朱蓓.抗感染治疗的新思考.中国新药杂志，1999，8（4）：220-221.

基金项目：

四川凉山州科技计划项目（NO．[2010]117号）；

通讯作者：

罗伦才（1964-），男，主任中药师，主要从事民族药物的开发研究及临床应用工作。