耐氨苄西林流感嗜血杆菌产β-内酰胺酶机制研究

耐氨苄西林流感嗜血杆菌产β-内酰胺酶机制研究

刘秀英

刘秀英(黑龙江省铁力市人民医院黑龙江铁力152500)

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2010)01-0136-02

【关键词】耐氨苄西林嗜血杆菌流感β-内酰胺酶

我国由于流感嗜血杆菌的分离率较低，对此问题的研究一直没有深入。本文作者在本实验室成功提高流感嗜血杆菌分离率的基础上，分离获得36株耐氨苄西林的流感嗜血杆菌，用纸片法测定它们产β-内酰胺酶的情况后，用PCR方法对产酶菌中β-内酰胺酶基因的存在与否进行了检测，对耐氨苄西林的流感嗜血杆菌产生β-内酰胺酶机制作了初步分析。

1材料和方法

1.1流感嗜血杆菌的分离培养收集痰或咽拭子标本，于1h内接种于改良的哥伦比亚巧克力琼脂平板中，置5%CO2孵箱，37℃孵育18～24h,对疑似流感嗜血杆菌的菌落分别于血琼脂和营养琼脂平板上作卫星试验，仅在血琼脂平板上卫星试验阳性者为流感嗜血杆菌。用常规的纸片法（K-B法）对每个菌株作体外药物敏感试验，根据美国NCCLS标准判读药敏结果。从平板上挑取耐氨苄西林的单菌落接种于含3ml液体HTM培养液的试管中，于5%CO2孵箱37℃孵育培养过夜，离心收集菌体用于质粒制备等后续实验。

1.2纸片法测定β-内酰胺酶将流感嗜血杆菌培养物经超声裂解后直接涂布于β-内酰胺酶纸片上，在15min内变红者为阳性。超声仪为BransonSonifier250，β-内酰胺酶纸片购自Oxid公司。

1.3PCR法检测β-内酰胺酶基因

1.3.1PCR引物针对β-内酰胺酶结构基因的PCR引物由本校分子遗传学开放实验室用PCGENE软件PCRPLAN程序设计，上海生工生物工程公司协助合成。引物序列为：上游引物：5′TGGGTGCACGAGTGGGTTAC3′，下游引物：5′TTATCCGCCTCCATCCAGTC3′。

1.3.2PCR反应条件用PE2400型DNA扩增仪,50μlPCR反应体系中含有模板DNA1μl、上游下游引物各1μl（浓度为25μmol/L），10×缓冲液5μl，dNTP混合物（10mmol/L）4μl，并用ddH2O补足至50μl（Mg2+的终浓度为1.5mmol/L），以94℃3min→(94℃1min→55℃1min→72℃1min，循环30次)→72℃7min→4℃保温。PCR反应后取10μl产物点样，进行琼脂糖凝胶电泳并拍照。

1.3.3PCR模板的制备细菌质粒DNA用常规碱裂解法分离、RNaseⅠ消化、酚/氯仿抽提纯化；细菌基因组DNA用菌体冻融法制备：取少量细菌于1.5ml塑料离心管中，用蒸馏水重悬，加入少量溶菌酶于37℃水浴5min，放入液氮迅速冰冻5min，取出后立即放入37℃水箱融化5min，重复冻融3次，室温下1×104r/min离心5min，吸取上清液到新的离心管，加入1.5倍体积的无水乙醇于-20℃沉淀30min，1.5×104r/min离心沉淀，用10μlTE溶解后备用。

2结果

2.1流感嗜血杆菌的分离自1997年10月至1998年11月,从我院呼吸内科及耳鼻咽喉科呼吸道感染患者中收集634份痰及咽拭子标本，分离鉴定出112株流感嗜血杆菌,其中，药敏试验证明为氨苄西林耐药的36株。

2.2β-内酰胺酶检测结果36株耐氨苄西林流感嗜血杆菌中，纸片法测得产酶菌株32株，耐药菌中产酶率88.9%(32/36)。

2.3PCR法检测β-内酰胺酶基因结果用针对β-内酰胺酶基因的上游和下游特异性引物扩增后，阳性条带大小为486bp，扩增结果与预期值相同。32株产酶菌中PCR阳性菌株29株，阳性率为90.6%。其中以质粒为模板PCR阳性菌株25株，占产酶菌的78.1%（25/32)；对7株质粒DNA模板PCR阴性的菌株，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果有4株为阳性。

3讨论

国外对耐氨苄西林流感嗜血杆菌产β-内酰胺酶的分子机制研究，主要采用的方法是在大量培养细菌的基础上，通过CsCl密度梯度超离心等方法获取较大量的质粒DNA，进行限制性内切酶酶切分析、琼脂糖凝胶电泳、质粒转化试验等，大致分析质粒DNA的大小、结构，验证质粒介导的耐氨苄西林表型等，获得质粒介导的产酶及其与耐氨苄西林药物的关系等的可靠证据。但是，自然状态的流感嗜血杆菌菌株中所携带的野生型质粒的大小、结构、拷贝数差异非常大，对细菌培养的数量、质粒抽提纯化的方法提出了很高的要求，其结构的变异也造成电泳、酶切分析等方法难以做到精确分析质粒的结构。另外，野生型质粒的分子量通常较大，常用的转化实验成功率不高；再加上野生型菌株中所含质粒结构复杂，而这些方法都未能直接鉴定质粒DNA中是否携带有编码β-内酰胺酶的基因。

鉴于上述情况，本实验设计了针对β-内酰胺酶基因的特异性引物，对所分离获得的产β-内酰胺酶的耐氨苄西林流感嗜血杆菌中该酶编码基因的存在情况进行了直接的PCR检测。结果发现，32株产β-内酰胺酶的流感嗜血杆菌，用可靠的碱变性法获取的质粒DNA为模板进行PCR检测，阳性率达到78.1%，而7株质粒DNA模板PCR阴性的产酶菌株中，有4株在以染色体DNA样品为模板进行的PCR反应中表现阳性。这些结果提示耐氨苄西林的流感嗜血杆菌编码β-内酰胺酶的基因主要存在于所携带的质粒DNA上，而有少部分酶基因位于染色体DNA上，这与文献报道的结论一致。从方法上看，本研究所采用的PCR法直接检测耐氨苄西林流感嗜血杆菌中β-内酰胺酶基因的方法，特异性高，标本产β-内酰胺酶的核苷酸序列具有高度的特异性；敏感性高，PCR方法可将待测DNA片断的量扩大百万倍，可以检测细菌含量极微的标本；既可以测质粒模板β-内酰胺酶基因，也可以测染色体模板β-内酰胺酶基因；如果配合PCR产物的序列测定等，还可用于β-内酰胺酶分类、基因序列分析、分子流行病学调查等。但PCR方法有假阳性的情况，如β-内酰胺酶基因结构出现变异但未影响PCR引物结合位点时，可能存在PCR阳性但基因并无活性的情况。从理论上讲，能产生β-内酰胺酶的菌株均应有相应的编码基因存在，但本实验中有3株PCR阴性，可能的原因是模板制备过程以及PCR反应过程所造成的假阴性所致。虽然国外有用PCR方法检测流感嗜血杆菌菌株、β-内酰胺酶基因及其分类的报道。