人皮肤鳞状细胞癌的细胞原代培养研究方法

人皮肤鳞状细胞癌的细胞原代培养研究方法

王嘉月

王嘉月（山西长治医学院附属和济医院病理科山西长治046000）

【摘要】目的探讨一种简便实用、成本低、纯度高并且成熟稳定的，体外培养人皮肤鳞状细胞癌癌细胞及建立原代细胞系的方法,为皮肤癌的研究奠定实验基础。方法对20份皮肤鳞癌患者的新鲜手术标本，采用组织块培养法和胶原酶消化悬液培养法进行体外培养。通过直接观察、细胞形态学观察和免疫细胞化学方法观察细胞的生长情况、细胞形态学特征及鉴定所得到的癌细胞情况。结果3份标本两种方法均培养出皮肤癌细胞,后者培养的细胞生长速度快。结论应用组织块和胶原酶消化法培养食管癌细胞,方法可行,适合推广应用。

【关键词】皮肤鳞状上皮癌细胞细胞培养细胞系

【中图分类号】R73-35+1【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）20-0117-02

皮肤鳞癌（SSCC）是起源于皮肤角朊细胞的一种恶性肿瘤，有时亦起源于附属器，包括毛囊漏斗、皮脂腺导管或末端汗腺的角朊细胞。SSCC在所有癌中占很大比重，Ackerman统计占全部癌肿的第一位，国内胡正祥等[1]统计其占第二位，我国各种皮肤癌发病率明显不同于西方国家，欧美统计皮肤癌中胞癌的比例约鳞癌占20%，而基底细胞癌占80%。我国与某些亚洲国家的情况正好相反，主要为鳞癌，鳞癌与基底细胞癌约为（5～10）∶1[2]。

SSCC的临床治疗以局部手术切除为主，辅以化疗，晚期肿瘤预后较差是因其发生深部浸润与远处转移。皮肤癌的发生机制始终是研究的热点问题之一,但目前尚未完全阐明[3]。体外分离、培养皮肤鳞癌细胞并建立细胞系,是研究皮肤癌生物学特性、癌变机理、指导治疗及判断预后必要的生物学模型。但皮肤癌细胞系的建立比较困难,目前国内已建立的皮肤癌细胞系较少。多数方法或不稳定可靠,或步骤复杂所用试剂昂贵,严重制约了后续的研究工作。本研究结合国内外的一些培养方法,采用传统的组织块法在含有低浓度血清的复合培养基中体外培养皮肤表皮细胞。以寻求一种适于推广的简便、快捷的方法，为体外进一步研究正常上皮细胞的恶性转化及治疗方面，提供可靠的细胞来源。

1材料与方法

1.1主要仪器和材料

人皮肤鳞状细胞癌癌细胞取自长治医学院附属和平医院皮肤科，自2009年10月-2010年10月皮肤鳞癌的手术标本20例。试剂购自于中杉公司。

1.2培养基制备

1.3皮肤鳞状上皮的取材及分离培养

以皮肤癌手术后3h以内的食管标本为材料。肉眼选取距肿瘤边缘3cm以外的大约2cm×3cm大小的皮肤组织,放入含有200U/ml青霉素、200mg/ml链霉素的1640培养基中,立即带回实验室。每次取材后,所取皮肤标本均经病理证实为正常的皮肤鳞状上皮细胞,无不典型增生及肿瘤细胞。在无菌条件下反复冲洗皮肤组织。置于1640培养基中,尽量剪除黏膜下血管和结缔组织,将黏膜剪成2mm2大小的组织块。在25ml培养瓶底部涂布胎牛血清,并且放入温箱中稍晾干,将剪好的黏膜贴于培养瓶内,黏膜面均朝上,每瓶9块,每个组织块间相隔1cm,然后加入少量DMEM与F12混合(1∶1)培养基使组织块湿润,其后48h内将瓶中的培养基加到2ml。放入37℃、5%CO2的培养箱培养。以后每2～3天换液一次。5天后开始有细胞从组织块边缘长出,14天后换液均去掉漂浮的组织块。每个组织块所长出的上皮晕直径可有2～3cm,4～5个组织块长出的细胞可以覆盖培养瓶底。以后将组织块迁移到新的培养瓶中,按上述方法培养,组织块可以被连续迁移数次,每次均有细胞长出,状态良好生长稳定。同时,使用1640培养基应用上述方法进行皮肤上皮细胞的原代培养,观察培养细胞生长情况和状态。

1.4细胞学观察及鉴定

当有细胞从组织块边缘爬出后,以倒置相差显微镜观察活细胞形态,盖玻片制作细胞爬片,常规HE染色,普通光学显微镜下观察细胞形态。透射电子显微镜观察细胞超微结构。免疫组化方法鉴定细胞分子标记,使用角蛋白(CK)多克隆抗体,按免疫组化试剂盒说明进行,普通光学显微镜下观察CK蛋白在细胞中的表达情况,胞浆棕黄色表明细胞角蛋白阳性。

1.5细胞活力检测

活细胞直接观察、细胞计数法绘制细胞生长曲线、锥虫蓝活力鉴定参照文献[4]。

2细胞学观察结果

2.1细胞培养情况

细胞培养情况组织块培养法:组织块接种后第2天周边开始出现圆形透亮的细胞,第7天开始周边爬出上皮细胞贴壁生长,第10天开始上皮晕逐渐向外周扩大,细胞单层紧密镶嵌排列,呈多角形,到第20天上皮晕融合成片,给予首次传代。此后每4～6天传代1次。胶原酶消化法:悬液接种后第2天大部分细胞已贴壁,细胞聚集成团散在分布,第5天细胞团块周边开始爬出细胞,形成上皮晕后细胞紧密镶嵌排列,第14天细胞生长融合给予首次传代,此后每3～5天传代1次。

2.2细胞形态学观察及鉴定

倒置相差显微镜下观察,细胞主要呈多角形,大小不等,胞浆丰富,胞核圆或卵圆形,大小不等,核浆比例增大或正常,核仁明显,2～6个,每视野可见多个分裂相,可见体积较大的双核或多核瘤巨细胞。HE染色后细胞形态与倒置显微镜下观察相似,部分细胞胞浆着色深,为富含角质的细胞。透射电镜下观察细胞表面有微绒毛样突起,细胞内有线粒体、粗面内质网、核糖体等结构,胞浆中有较多的张力丝,细胞间桥粒明显。细胞爬片CK表达强阳性,胞浆呈棕黄色颗粒,进一步确定细胞为上皮源性。

2.3上皮细胞生长曲线

生长曲线显示,上皮细胞数目在K2SFM中，第1～2天为生长潜伏期,第3～5天为对数生长期,第7天细胞开始死亡,细胞倍增时间约为30h。第2天有所减少,主要是部分细胞未贴壁随换液而丢失的缘故;第3天以后迅速增殖,呈对数增长趋势,其倍增天数为1.086d,细胞相互融合而不利于增殖,故细胞增殖速度减慢,提示需要再行传代培养;细胞周期分析表明,2倍体峰较为宽大,4倍体峰低平,G0+G1期占53.86%,S期占18.28%,G2+M期占27.86%,G2/G1=1.98。

3讨论

本研究应用组织块和胶原酶消化法培养皮肤癌细胞,本方法可以稳定地培养皮肤原代细胞,简捷、方便、试验周期短,易于推广。

决定原代培养及细胞系成功建立的因素很多,其中细胞培养过程、肿瘤性状、细胞的生物学特性以及所处微环境等均起重要作用。皮肤癌组织原代培养多采用组织块法,其操作简便,利用块内肿瘤细胞自行游离爬出进行培养,细胞游离生长速度慢;但由于不能保证所有组织块均彻底消毒无菌,所以很难避免霉菌污染的问题;另外,组织块中游离出的成纤维细胞、部分组织块在培养过程中可漂起,对实验结果造成很大影响。国外有报道使用胶原酶消化法获得原代肿瘤细胞的成功率为22.2%(2/9),其相对组织块法效果更确切,消化完毕收获的癌细胞可较早贴壁生长,胶原酶较特异地消化纤维组织,对癌上皮细胞影响不大,掌握好消化条件并利用成纤维细胞和癌细胞差速贴壁可以有效的分离出癌细胞。本研究采用上述两种方法对20例新鲜标本进行原代培养,其中3例获得原代肿瘤细胞,均传代十代以上,可满足实验需要。

1993年,Schettini等[5]借鉴表皮细胞的培养方法,以常规用于表皮细胞培养的KGM培养液进行皮肤上皮细胞的原代培养,其KGM培养液含0.5μg/ml氢化可的松,5μg/ml胰岛素,皮肤上皮生长因子(EGF)0.1ng/ml,牛垂体提取物(BPE)70μg/ml、青霉素100IU/ml和链霉素100μg/ml,取得了非常好的培养结果。国内秦雄等[6]报道以消化法即细胞悬液法进行新生小牛食管的原代培养,他们使用的培养液是DMEM(Gibco公司)完全培养液,含20%胎牛血清、青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml、胰岛素10μg/ml、氢化可的松500ng/ml、转铁蛋白5μg/ml。

本研究原代培养出的人皮肤癌细胞,为开展细胞表面分子筛选、细胞药物敏感试验、癌症干细胞的分选与鉴定等奠定了良好的实验基础,在后续工作中将进行深入研究。

参考文献

[1]FerlayJ，BrayF，PisaniP，etal,Globacan2000:Cancerincidence,wortalityandprevalenceworldwide.IARCCancerBaseNo.5lyon:IARC2001CD-ROM.

[2]邱丙森.表皮肿瘤//杨国亮主编.皮肤病学[M].上海:上海医科大学出版社,1992:799-803.

[3]冯新,王建力,鄂群等.组织芯片免疫组化检测皮肤鳞癌间质反应对癌病理分级的影响.南通大学学报2010,30(2):89-93.

[4]鄂征.上皮细胞类培养—组织培养和分子细胞学技术[M].北京:医学文库,1995,121.

[5]SchettiniST,PinusJ.Gastric-tubeesophagoplastyinchildren[J].PediatrSurgInt,1998,14(122):144-150.

[6]秦雄,徐志飞.食管上皮细胞的体外原代培养及形态学观察[J].解剖学杂志,2002,25(6):495-496.