5-HT及5-HT4受体在正常肾上腺皮质和肾上腺皮质腺瘤组织中表达的研究

5-HT及5-HT4受体在正常肾上腺皮质和肾上腺皮质腺瘤组织中表达的研究

钱晓辉1赵军2

钱晓辉1赵军2

1.长沙市第四医院泌尿外科；2.华中科技大学同济医学院附属协和医院泌尿外科

【摘要】目的：观察5-HT和5-HT4R在人正常肾上腺皮质组织和皮质腺瘤中的分布特点。方法：对10例正常肾上腺皮质组织和33例皮质腺瘤组织进行SP法免疫组化染色。结果：正常肾上腺组织中5-HT由血管旁肥大细胞产生、贮存。5-HT4R主要在肾上腺球状带出现少量表达，在束状带和网状带表达更少；而肾上腺皮质腺瘤许多产类固醇细胞上5-HT和5-HT4R染色均呈显著表达，分别是正常皮质组织的6—12.5倍和3—10倍。表达强度在统计学上具有显著性差异（P＜0.05）。结论：肾上腺腺瘤细胞不但产生而且5-HT，而且同时表达5-HT4R，5-HT可能通过与5-HT4R结合，促使腺瘤的增殖及功能表达，使皮质醇或醛固酮产生释放增加。

【关键词】5-HT；5-HT4受体；肾上腺皮质腺瘤；免疫组织化学

研究发现，在一些肾上腺皮质腺瘤和产生皮质醇的ACTH非依赖性大结节样肾上腺皮质增生（AIMAH）上可出现异位/异常膜受体的表达增多，且均为G蛋白偶联受体（GPCRs）。当体内相应激素水平发生改变时，受体活性增高并表现出类似ACTH受体的功能，刺激皮质组织增生以及皮质醇/醛固酮的合成和释放，同时可逃脱血浆皮质醇/醛固酮水平增高后的负反馈调节作用。这些异常表达增多或异位表达的受体包括：5-HT4受体、GIP受体、血管加压素受体、β-儿茶酚胺受体、LH/HCG受体以及血管紧张素II（AT-2）受体、来普汀（Leptin）受体等[1］。

我们采用免疫组织化学的方法对5-HT及5-HT4R在正常肾上腺皮质和肾上腺皮质腺瘤组织中表达情况进行研究，以了解5-HT及5-HT4R的表达情况与肾上腺皮质腺瘤发生的关系，为进一步探讨5-HT及5-HT4R在皮质腺瘤发病机制中的作用提供依据。

1材料和方法

1.1组织

选择武汉协和医院病理科2010—2015年术后确诊肾上腺皮质腺瘤标本33例，男性13例，女性20例，男：女约为3：5，年龄22—55岁（平均42.5岁），其中20例为原发性醛固酮增多症，6例为Cushing综合症，7例为无功能性腺瘤。标本均备常规HE染色和免疫组化染色，光镜观察。将经病理证实为正常的10例肾上腺作为对照。

1.2试剂及来源

5-HT兔抗人多克隆抗体购置自武汉博士德生物工程有限公司；5-HT4R兔抗人多克隆抗体置自武汉晶美生物科技有限公司。免疫组化S-P二步法试剂盒和DAB显色剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3实验方法

5-HT及5-HT4R免疫组化染色采用S-P方法。

1.4结果判断标准：

1.4.15-HT免疫组化染色：

阳性标准：在800倍镜视野下，5-HT免疫组化染色，在正常皮质细胞或腺瘤细胞胞浆内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞，背底不着色或呈淡黄色，胞核为阴性。

阳性分级：在800倍镜视野下随机选取5个视野，计数100个细胞，统计阳性细胞百分比，每个视野计数3次后取平均值。阳性细胞0：-；阳性细胞1—10：＋；阳性细胞10—20：＋＋；阳性细胞＞20：＋＋＋。

1.4.25-HT4R免疫组化染色：

阳性标准：在800倍镜视野下，5-HT4R免疫组化染色，腺瘤细胞膜显著棕黄色着色，无胞浆或胞核内染色。正常肾上腺皮质球状带细胞膜则可呈轻微染色，胞浆及胞核内均无染色。

阳性分级：在800倍镜视野下随机选取5个视野，计数100个细胞，统计阳性细胞百分比，每个视野计数3次后取平均值。阳性细胞0：－；阳性细胞1—10：＋；阳性细胞10—20：＋＋；阳性细胞＞20：＋＋＋。

采用单盲，重复观察等方法。

1.5统计学处理

结果采用统计学卡方检验法分析处理，P＜0.05为差异有显著性。

2结果

2.15-HT及5-HT4R阳性表达分布：

5-HT在正常肾上腺皮质中仅分布于血管旁肥大细胞中，皮质细胞中则不出现（图1）；而在腺瘤组织主要分布在腺瘤细胞和瘤体血管周围肥大细胞中（图3），呈散在阳性或弥漫性阳性着色，主要定位于细胞浆内，呈匀质或细颗粒状。5-HT4R在正常肾上腺球状带细胞膜上少量出现，在束状带和网状带表达更少（图2）；在腺瘤组织主要分布在腺瘤细胞膜上（图4），主要表达在球状带和束状带中，间质无表达。二者在腺瘤组织的分布区域基本一致。

2.25-HT及5-HT4R阳性表达强度（阳性细胞百分比）：

5-HT在正常肾上腺皮质组织中表达水平为0.40%—2.20%（平均数1.36%±0.41%），在腺瘤组织中为2.40%—27.4%（平均数14.1%±4.5%），表达强度是正常组织的6—12.5倍，表达强度差异具有显著性（P＜0.05）。其中在无功能腺瘤中表达水平为5.6%，皮质醇腺瘤中为12.5%，而在醛固酮腺瘤中则为17.8%。

5-HT4R在正常肾上腺皮质组织中表达水平为0.60%—3.80%（平均数1.76%±0.42%），而在腺瘤组织中则为1.90%—39.0%（平均数15.6%±7.46%），表达强度是正常组织的3—10倍。表达强度的差异具有显著性（P＜0.05）。其中在无功能腺瘤中表达水平为6.1%，皮质醇腺瘤中为13.6%，而在醛固酮腺瘤中则为19.5%。

图3腺瘤细胞内5-HT图4腺瘤细胞膜上5-HT4R

3讨论

5-羟色胺是胺类神经递质，通过特异性的5-HT受体参与人体生理和病理过程。5-HT受体是一个庞大的家族，已经发现的人类5-HTR共有7种类型，并且还可以进一步分成若干亚型。

在正常肾上腺皮质，5-HT仅在血管周围肥大细胞中产生、储存，并由其释放[2]。体外实验发现，每毫克湿润的肾上腺皮质组织每分钟可产生（0.74±0.38）fmol5-HT。而正常肾上腺皮质中表达的5-HT受体主要是5-HT4R，其主要在肾上腺球状带出现少量表达，同时在束状带和网状带细胞膜上也可出现[3]。

由于血浆中5-HT生理浓度水平很低（＜10-9M），因此循环血液中的5-HT对于腺瘤组织皮质醇/醛固酮分泌的刺激作用应当很小，所以由腺瘤组织在局部产生的5-HT应当是刺激皮质醇/醛固酮分泌的主要因素。实验发现产皮质醇/醛固酮的肾上腺皮质腺瘤，在生成皮质醇/醛固酮的亚群细胞中和瘤体血管周围肥大细胞胞浆中表现出明显5-HT免疫反应阳性（平均数14.16%±4.5%），同时在腺瘤细胞膜上发现5-HT4受体异常增多（平均数15.6%±7.46%），远远高于正常肾上腺皮质细胞上的表达水平（平均数1.76%±0.426%），并且二者的分布范围大致相同，这说明腺瘤组织中5-HT的来源除肥大细胞外，腺瘤细胞本身即具有生成、储存和释放5-HT的功能，释放之后，与自身或周围细胞膜上异常增多的5-HT4R结合，就像是一种营养刺激因子，并且不受皮质醇/醛固酮的负反馈影响，形成了新的不受调节的营养刺激，使肾上腺腺瘤细胞功能亢进和细胞增殖。在腺瘤中，无功能腺瘤中5-HT和5-HT4R表达的水平最低，而皮质醇腺瘤和醛固酮腺瘤中则较高，说明5-HT4R的数量增多和活性受体比例可能对于激素的产生释放具有重要意义。

类似现象也见于其他肿瘤。如对手术肝癌标本和人肝癌细胞系HCC-9204的研究显示，肝癌细胞可能存在自分泌5-HT的机制，并可以与自身的受体结合，传递相关信息［4］。Cattaneo等发现5-HT可以促进小细胞肺癌细胞的有丝分裂[5]，如果应用5-HT1R的阻滞剂-螺哌隆和SDZ216-525便可阻断以上作用。Sheehan等则发现如给与小剂量的5-HT1R/5-HT2R激动剂可以使支气管肺癌肿瘤细胞的倍增时间缩短，而5-HT2DR阻滞剂如酮色林、胺硫桂苯胺则使倍增时间明显增加[6]。

4结论

肾上腺皮质腺瘤细胞合成和释放5-HT增多，且5-HT4R表达上调，促进腺瘤的增值以及功能表达。希望通过对5-HT及5-HT4R亚型的进一步研究，寻找特异的拮抗剂来阻断异常激素受体或抑制其配体，为不适合进行手术治疗的患者提供新的治疗选择。

参考文献:

[1]StavroulaC，IsabelleB，2005AberrantExpressionofHormoneReceptorsinAdrenalCushing’sSyndrome.

[2]LefebvreH，ContesseV，DelarueC1992Serotonin-inducedstimulationofcortisolsecretionfromhumanadrenocorticaltissueismediatedthroughactivationofaserotonin4receptorsubtype.Neuroscience47：999–1007

[3]MassimoM，PietroF，PaolaL2003Cushing’sSyndromeinaPatientwithBilateralMacronodularAdrenalHyperplasiaRespondingtoCisapride：AninVivoandinVitroStudy.TheJournalofClinicalEndocrinology&Metabolism88（10）：4616–4622

[4]张充.5-HT及其受体与人肝细胞性肝癌增殖的关系.中华肝脏病杂志.2000；6：134

[5]CattaneoMG，FesceRandVicentiniLM.Mitogeniceffectofserotonininhumansmallcelllungcarcinomacellsvioboth5-HT1Aand5-HT1Dreceptor.Eur.JPharmacol1995Oct，15；291（2）：209

[6]SheehanPF，BakerTandTuttonPJetal.Effectshistamineand5-HTonthegrowthrateofxenogratteshumanbronchogeniccarcinomas.ClinExpPharmacolPhysiol.1996Jun-Jul，23（6-7）：465

作者简介：

钱晓辉，湖南长沙市410006湖南省长沙市第四医院泌尿外科；赵军，华中科技大学同济医学院附属协和医院泌尿外科，通讯作者：钱晓辉E-mail：359694415@QQ.com