熄风活络胶囊微生物限度检查方法验证

熄风活络胶囊微生物限度检查方法验证

刘水平1胡雪来2

1株洲市食品药品检验所湖南株洲412008；2湖南中医药高等专科学校附属第一医院（湖南省直中医医院）湖南株洲412000

【摘要】目的：建立熄风活络胶囊的微生物限度检查方法。方法：按照《中国药典》2010版一部附录微生物限度检查法验证的要求对熄风活络胶囊微生物限度检查进行了方法建立和验证研究。供试液制备采用稀释法，制成1∶10供试液。采用培养基稀释法（1∶10供试液，每皿1mL）进行细菌计数检验，稀释法（1∶10供试液，每皿1mL）进行霉菌及酵母菌计数检验，采用常规法进行控制菌检查。结果：5种验证菌株的回收率均高于70%；控制菌检查经方法验证，可按常规法进行大肠埃希菌，大肠菌群及沙门菌检查。结论：建立的方法准确、可靠、重现性好，适用于熄风活络胶囊的微生物限度检查。

【关键词】熄风活络胶囊；微生物限度；方法验证

熄风活络胶囊是由当归、桃仁、白芷、酒大黄等20味中药组成的医院自制制剂，功能熄风豁痰，活血通络，主治中风病早、中期。按《中国药典2010年版一部》[1]要求，需做细菌数、霉菌及酵母菌数、控制菌检查，同时需对检验方法进行验证，以确保检验方法的准确可靠。

1试验材料

1.1仪器净化工作台、全自动立式压力蒸汽消毒器、恒温水浴锅、TP-320A电子天平（感量0.01g）、恒温培养箱（30～35℃）、生化培养箱（25～28℃）、锥形瓶（100～150mL）、平皿（90mm）、量筒（100m1）、试管（18×180mm）及塞、吸管（1m1分度0.01mL，10mL分度0.1mL）均于180℃干热灭菌2h或高压蒸汽121℃灭菌30min，烘干备用。

1.2试验样品熄风活络胶囊湖南中医药高等专科学校附属第一医院批号：140922、140825、141213。

1.3实验方法按《中国药典2010年版一部》常规法，采用1mL供试液加一个平皿，注入15～20mL培养基作菌落计数。

1.4实验菌株金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、大肠埃希菌CMCC（B）44102、枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501、白色念珠菌CMCC（F）98001，乙型副伤寒沙门菌CMCC（B）50094、黑曲霉CMCC（F）98003等，均购自中国医学细菌保藏中心。

1.5培养基营养琼脂培养基（批号：140225）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号：141203）、改良马丁培养基（批号：140527）、改良马丁琼脂培养基（批号：140208）、营养肉汤培养基（批号：140614）、胆盐乳糖培养基（批号：1411151）（均由北京路桥技术有限公司生产）；MUG培养基（批号：201404233）（由广东环凯微生物科技有限公司生产）

1.6试剂及稀释剂pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液（批号：140216，由北京路桥技术有限公司生产），0.9％灭菌氯化钠溶液、靛基质试液。

2细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证[2][3]

验证试验进行三次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。

2.1方法

2.1.1菌液制备接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养肉汤中，在30～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，在25℃培养24～48小时。上述培养物均用0.9％灭菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数为50～1OOCFU的菌悬液，备用。

2.1.2供试液制备分别取供试品各10g，加pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液至100mL，制成1：10的均匀供试液，备用。

2.1.3试验组细菌计数采用常规法。取1：10的供试液1mL，置平皿中，每个平皿加试验菌液1mL．加入营养琼脂培养基15～20mL，平行制备2个平皿，放冷，倒置平板，在30～35℃温度培养48小时，观察结果。按《中国药典2010年版一部》微生物限度菌落计数方法测定菌数。

霉菌和酵母菌计数采用常规法，取1：10的供试液1mL．置平皿中，每个平皿加试验菌液1mL，加入玫瑰红钠琼脂培养基15～20mL，平行制备2个平皿，放冷，倒置平板，在25℃温度培养72小时，观察结果。按《中国药典2010年版一部》微生物限度菌落计数方法测定菌数。

2.1.4菌液组分别取50～100CFU／mL的试验菌液1mL注入平皿中，立即倾注培养基，平行制备2个平皿，置适宜温度培养48～72小时，观察结果，按《中国约典2010年版一部》微生物限度菌落计数方法测定菌数。

2.1.5供试品对照组按《中国药典2010年版一部》微生物限度菌落计数方法测定本品的本底数。采用常规法检查细菌数、霉菌及酵母菌数。

2.1.6稀释剂对照组取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1mL代替供试液，余下同试验组。

2.2菌回收率试验验证试验进行三次独立的平行试验，并分别计算各次试验的菌回收率。

2.3结果判断试验组及对照组的各种菌的菌回收率均应不低于70％。

2.4实验结果经试验验证，各试验菌株及稀释剂对照组菌回收率均大于70％，符合《中国药典2010年版》常规法要求，结果见表1。

3控制菌检查方法的验证[2][3]

本品为口服制剂，含药材原粉，因此以大肠埃希菌作为验证菌株，检查大肠埃希菌，大肠菌群，以金黄色葡萄球菌为阴性对照菌株；以乙型副伤寒沙门菌作为验证菌株，检查沙门菌，以金黄色葡萄球菌为阴性对照菌株。

菌液：取细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证中的50～100CUF/mL的大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌菌悬液。

3.1大肠埃希菌

3.1.1试验组取1：10的供试液10mL以及50—100CUF/mL的大肠埃希菌菌液1mL接种至1OOmL胆盐乳糖培养基中，在35℃培养18～24小时。

3.1.2阴性对照组取1：10的供试液10mL及50～100CUF/mL的金黄色葡萄球菌悬液1mL接种至10OmL的胆盐乳糖培养基中，在35℃培养18～24小时。

3.1.3结果判断取上述培养物0.2mL，接种至含5mLMUG培养基的试管内，培养于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后沿培养基的管壁加入数靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。

3.1.4实验结果大肠埃希菌检查法采用常规法检查，阳性对照菌能正常生长，阴性对照菌未检出。结果见表2

3.2大肠菌群

3.2.1试验组取1：10、1：100、1：1000的供试液各1mL分别加至含10mL的胆盐乳糖发酵培养基管中，再分别加入50～100CFU/mL的大肠埃希菌菌悬液1mL，在35℃培养18～24小时。

3.2.2阴性菌对照组1：10、1：100、1：1000的供试液各1mL分别加至含1OmL的胆盐乳糖发酵培养基管中，再分别加入50～1OOCFU/mL金黄色葡萄球菌菌悬液1mL、在35℃培养18～24小时。

3.2.3结果判断胆盐乳糖发酵管若无菌生长、或有菌生长但不产酸产气，判该管未检出大肠菌群，若产酸产气，应取上述培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基的平板上，培养24小时，对疑似菌落进行确证。

3.2.4实验结果大肠菌群检查法采用常规法检查，阳性对照菌能正常生长，阴性对照菌未险出。结果见表3。

3.3沙门菌

3.3.1试验组取1：10的供试液10mL及50～100CFU／mL的乙型副伤寒沙门菌菌悬液1mL加至200mL的营养肉汤培养基管中，摇匀，在35℃培养18～24小时。

3.3.2阴性菌对照组取1：10的供试液1OmL及50～100CFU／mL的金黄色葡萄球菌菌悬液1mL加至200mL的营养肉汤培养基管中，摇匀，在35℃培养18～24小时。

3.3.3结果判断再取上述培养物1mL，接种于10mL四硫磺酸钠亮绿培养基中，在35℃培养18～24小时后，分别划线接种于胆盐硫乳琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。

3.3.4实验结果沙门菌检查法采用常规法检查，阳性对照菌能正常生长，阴性对照菌未检出。结果见表4。

4验证试验小结

上述试验表明：本品采用常规法对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌、白色念珠菌生长均无影响。其试验组、稀释剂对照组回收率均达70%以上，同时按常规法对大肠埃希菌、大肠菌群及沙门菌进行了验证试验，符合《中国药典2010年版一部》微生物限度检查验证试验要求。以此确定本品微生物限度检查法如下：取本品10g加pH7．O无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL制成1：10供试液。采取常规法检查细菌数、霉菌和酵母菌数，采用常规法检查大肠埃希菌、大肠菌群及沙门菌。

参考文献：

[1]潘雯，关倩明，林玲.活络油微生物限度检查的方法验证[J].今日药学，2013，11（14）：736-739.

[2]戚继红，蒋孜杰.通心络胶囊微生物限度检查方法验证[J].临床合理用药杂志，2015，8（23）：39-40.

[3]高永宾，张久胜.清开灵软胶囊微生物限度检查方法验证[J].亚太传统医药，2013，2（19）：21-22.

[4]李志红，王磊.参松养心胶囊微生物限度检查方法验证[J].今日药学，2013，2（18）：91-94.

[5]蒋晓兰，张涛，马哲，李彦，等.人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证[J].亚太传统医药，2014，17（13）：31-32.