SDF-1/CXCR4-PI3K信号通路对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖与凋亡的影响

SDF-1/CXCR4-PI3K信号通路对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖与凋亡的影响

易敏

易敏

（湘潭职业技术学院外科教研室湖南湘潭411101）

【摘要】目的：探讨SDF-1/CXCR4-PI3K信号通路对乳腺癌增殖和凋亡的影响，为临床治疗乳腺癌提供新的思路和方法。方法：以乳腺癌MDA-MB-231细胞系为研究对象，通过免疫细胞化学、MTT比色法、软琼脂克隆形成实验、流式细胞仪等方法检测经SDF-1/CXCR4-PI3K信号通路特异性阻断剂AMD3100和LY294002分别处理及联合处理后，MDA-MB-231细胞增殖和凋亡能力的变化。结果：免疫细胞化学检测结果表明，乳腺癌MDA-MB-231细胞表达CXCR4蛋白。AMD3100抑制剂不影响CXCR4蛋白表达，LY294002抑制剂下调p-AKT蛋白表达。MTT比色法和软琼脂克隆形成实验证实MDA-MB-231细胞经AMD3100、LY29400或AMD3100+LY294002作用后其增殖能力与对照组相比较明显降低(P＜005，n=5)。流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡结果表明，MDA-MB-231细胞在AMD3100、LY29400或AMD3100+LY294002作用下其DNA复制停滞于G2/M期，并且出现明显的“亚二倍体”凋亡峰，其凋亡率明显高于对照组(P＜001，n=3)。结论：AMD3100和LY294002可抑制乳腺癌细胞的增殖能力，促进凋亡。SDF-1/CXCR4-PI3K信号通路可能以抑制细胞凋亡的形式参与了肿瘤的形成过程，是参与乳腺癌细胞增殖的一条重要信号转导途径。为临床治疗乳腺癌提供了新的思路和方法。

【关键词】SDF-1/CXCR4-PI3K；MDA-MB-231乳腺癌细胞EffectofSDF-1/CXCR4-PI3KsignalpathwayonproliferationandapoptosisofbreastcancercelllineMDA-MB-231

YiMin(XiangtanVocationalandTechnicalCollegeDepartmentofsurgery,Hunan,Xiangtan,411101)

【Abstract】Objective:ToinvestigatetheeffectofSDF-1/CXCR4-PI3Ksignalpathwayonproliferationandapoptosisofbreastcancer,toprovidenewideasandmethodsforthetreatmentofbreastcancer.Methods:ThebreastcancerMDA-MB-231celllineastheresearchobject,byimmunocytochemistry,MTTcolorimetricassay,softagarcolonyformationassay,flowcytometrymethodviaSDF-1/CXCR4-PI3KpathwayspecificinhibitorAMD3100andLY294002respectivelyandcombinedtreatment,changeintheabilityofproliferationandapoptosisofMDA-MB-231cells.Results:Theresultsofimmunocytochemistryassayshowedthat,theexpressionofCXCR4inbreastcancercelllineMDA-MB-231.AMD3100inhibitorsdonotaffecttheproteinexpressionofCXCR4,LY294002inhibitorsreducedexpressionofp-AKTprotein.MTTassayandsoftagarcolonyformationassaydemonstratedthatMDA-MB-231cellstreatedwithAMD3100,LY29400orAMD3100+LY294002aftertheirproliferationabilitycomparedwiththecontrolgroupdecreasedsignificantly(P<0.05,n=5).FlowcytometrycellcycleandapoptosisofMDA-MB-231cellsshowedthat,inAMD3100,LY29400orAMD3100+LY294002undertheDNAreplicationarrestinG2/Mphase,andtheobvious"hypodiploidapoptoticpeak",theapoptosisratewasobviouslyhigherthanthatofthecontrolgroup(P<0.01,n=3).Conclusion:AMD3100andLY294002caninhibittheproliferationofbreastcancercells,apoptosis.SDF-1/CXCR4-PI3Ksignalingpathwaytoinhibitapoptosisisinvolvedintheformationoftumor,isanimportantsignaltransductionpathwayintheproliferationofbreastcancercells.Providesanewideaandmethodforthetreatmentofbreastcancer.

【Keywords】SDF-1/cxcr4-pi3k,MDA-MB-231,breastcancercells

【中图分类号】R3392+3【文献标识码】B【文章编号】1003-5028(2013)10-0468-03

前言

乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤之一。在世界范围内乳腺癌的发病率呈上升趋势。乳腺癌患者的预后与肿瘤的复发、转移密切相关，远处转移己成为制约患者长期生存和改善预后的主要障碍。肿瘤细胞的转移是肿瘤恶性的最本质表现。目前对体内存在的微小转移癌灶尚难发现，早期筛选出具有潜在转移危险性的患者，予以彻底控制是提高乳腺癌疗效的关键所在。CXCR4是一个含352个氨基酸且高度保守的G蛋白偶联七次跨膜受体。胚胎早期几乎所有器官均表达，对人体脑、脊髓、骨髓的生长发育有重要作用。基质细胞衍生因子-1是骨髓基质细胞产生的CXC类趋化蛋白，系统命名CXCL12，是已知唯一能与受体CXCR4结合并能激活它的天然趋化因子。CXCL12与CXCR4具有高度的亲和力，两者特异性结合后形成的SDF-1/CXCR4生物学信号通路是其生物学功能实现的分子基础。近年来趋化因子受体CXCR4及其配体SDF-1/CXCR4相互作用形成的生物学信号通路在肿瘤形成中的作用越来越受到人们的关注。本研究运用CXCR4和PI3K的特异性抑制剂进行体外实验性干预，以乳腺癌细胞增殖、凋亡为重点，分析研究SDF-1/CXCR4-PI3K信号是否能够调控肿瘤细胞的增殖凋亡从而影响肿瘤的形成，为以后进一步研究工作打好基础。

1资料与方法

11细胞培养及药物处理人乳腺癌MDA-MB-231细胞接种于含100ml/L优级胎牛血清的L-DMEM培养液中，置入37℃、5%CO2和饱和湿度的孵育箱培养。细胞培养2d，待细胞长满瓶底的80-90%时，倾去培养瓶中的培养液，加入01%胰酶/005%EDTA消化液消化，再加入L-DMEM培养液制成细胞悬液，以离心法进行传代。实验设置空白对照组，不加任何处理因素；AMD3100处理组（10μmol/L）；LY294002处理组（10）；AMD3100+LY294002（10+10μmol/L），分别培养24，48和72h后进行免疫细胞化学、MTT、软琼脂克隆及流式细胞分析。

12免疫细胞化学检测：药物处理后，MDA-MB-231细胞CXCR4和p-AKT蛋白表达细胞培养于预先放有无菌盖玻片的6孔培养板，药物处理72h后，细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗3遍，2%多聚甲醛4℃固定15分钟，PBS洗3次，每次5分钟，05%TritonX-100穿透10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。3%山羊血清室温下封闭1小时，1:100加入CXCR4和p-AKT小鼠抗人一抗工作液，室温下孵育l小时，PBS洗3遍，每次5分钟，适当比例稀释的二抗室温孵育1h，PBS洗3次，DAB显色，苏木素复染，封片，KAPPAImageBase图像系统成像。

13MTT实验检测药物处理后，MDA-MB-231细胞生长能力取对数生长期细胞，融合达到80%时候，用025%胰酶消化后，悬浮细胞计数，调整细胞密度，以每孔5000-10000个细胞接种在96孔细胞培养板中，每孔体积约200μl。放入37℃、体积分数为5%C02饱和湿度的CO2孵箱培养培养24h，细胞基本贴壁后，药物处理细胞，时间点选取为24h、48h、72h和96h。终止培养后吸去孔内的培养液，每孔加入MTT溶液（5mg/m1）20μl，37℃继续孵育4h，后吸取上清，每孔加入150μl二甲基亚砜，摇匀后充分振荡10min，使结晶物溶解完全。用酶联免疫仪在570nm波长测定每孔吸光度，同时设置调零孔与对照孔。每组重复实验3次，吸光度用均数±标准差(x+s)表示，记录结果并统计分析。

14软琼脂克隆实验检测:药物处理后，MDA-MB-231细胞克隆形成能力取对数生长期细胞用于软琼脂克隆实验。细胞计数同MTT实验。接种细胞：根据细胞生长速度及处理时间的不同，以每孔400个细胞接种于铺好软琼脂的6孔培养板中。将细胞置于培养箱内培养过夜后，药物处理细胞72h，再以含10%优级胎牛血清的L-DMEM培养液继续培养24d。用4%的多聚甲醛固定后，01%的结晶紫4℃染色过夜。计数每组克隆数，计算克隆形成率。克隆形成率=平均克隆数/接种细胞数×100%。

15流式细胞分析:物处理后，MDA-MB-231细胞周期和凋亡取对数生长期细胞，融合达到80%时候，用025%胰酶消化后，悬浮细胞计数，调整细胞密度，以每孔1×106个/ml细胞接种在10cm细胞培养皿中。放入37℃、体积分数为5%CO2饱和湿度的CO2孵箱培养培养24h，细胞基本贴壁后，药物处理细胞72h。以胰蛋白酶消化，分别收集和计数细胞；将试管以1000转/分离心5min，弃上清液，加入4℃PBS，涡旋方式混匀，再离心，如此洗涤细胞2次；将洗过的细胞用05ml的PBS悬浮起来，把细胞悬液加入EP管中。加入PBS约1ml，以1500转/分离心细胞悬浮液3min，弃上清液，如此再洗涤细胞2次；将4℃75%乙醇约05ml加入EP管，固定细胞；以1500转/min离心细胞悬浮液5min，倾去固定液。再加PBS离心洗涤细胞1次；RNA酶溶于112%柠檬酸钠，配成5000U/ml，75℃热处理30分钟，使其中的DNA酶失活。离心去除RNA酶，再经PBS洗1次，去上清液；碘化丙啶溶于PBS配成50ug/ml。每106细胞加50ug/ml的PI1ml，室温下避光染色20min以铜网过滤；上流式细胞仪测定，用multycdeDNA分析软件包进行细胞周期分析。

16统计学分析:采用统计学SPSS130软件处理。计量资料以均数±标准差（χ±s）表示，两组间比较采用t检验，样本间多组间比较采用单因素方差分析。P＜005认为差异有显著性具有统计学意义。

2结果

21人乳腺癌MDA-MB-231细胞CXCR4蛋白的表达:免疫细胞化学结果显示，MDA-MB-231细胞表达CXCR4蛋白，定位于细胞膜上，属于跨膜蛋白受体（如图1）。

图2MDA-MB-231细胞形态、数量及P-AKT蛋白表达图

23SDF-1/CXCR4-PI3K信号通路抑制剂对MDA-MB-231细胞生长能力的影响:MTT实验结果显示：与对照组相比，AMD3100、LY294002及AMD3100+LY294002可明显抑制MDA-MB-231细胞的生长速率；并且24h、48h、72h、96小时后MDA-MB-231细胞的存活率逐渐降低（如图3A所示）。

软琼脂克隆形成实验结果显示：与对照组（如图3Ba所示）相比，AMD3100（如图3Bb所示）处理72小时后，可抑制MDA-MB-231细胞的克隆形成，克隆形成的数量减少，克隆体积减小；LY294002（如图3Bc所示）处理72h后，可抑制MDA-MB-231细胞的克隆形成，克隆形成的数量减少，克隆体积减小；AMD3100+LY294002（如图3Bd所示）可显著抑制MDA-MB-231细胞的克隆形成，克隆形成的数量显著减少，克隆体积减小。计数细胞克隆形成，其统计结果显示：AMD3100、LY294002及AMD3100+LY294002处理72h后，与空白对照组比较，克隆形成数具有统计学差异(*P＜005，n=5；**P＜001，n=3)。

24SDF-1/CXCR4-PI3K信号通路抑制剂对MDA-MB-231细胞周期和凋亡的影响:细胞周期检测结果表明：与对照组（如图4Aa所示）相比，经AMD3100作用72h后，MDA-MB-231细胞在G0/G1期增多，S及G2/M期细胞数量减少（如图4Ab所示）。经LY294002作用72小时后，MDA-MB-231细胞在G0/G1期增多，S及G2/M期细胞数量减少（如图4Ac所示）。经AMD3100和LY294002共同作用72小时后，与对照组相比，MDA-MB-231细胞在G0/G1期显著增多，S及G2/M期细胞数量减少（如图4Ad所示）。计数细胞周期分布，其统计结果显示：AMD3100、LY294002及AMD3100+LY294002处理72h后，与空白对照组比较，G0/G1期细胞数增加有统计学差异(*P<005，n=5；**P<001，n=3)见表1。

同样，细胞凋亡检测结果表明:与对照组（如图4Ba所示）相比，经AMD3100作用72h小时后，MDA-MB-231细胞细胞凋亡明显增加（如图4Bb所示）。经LY294002作用72小时后，MDA-MB-231细胞凋亡明显增加（如图4Bc所示）。经AMD3100和LY294002共同作用72小时后，MDA-MB-231细胞凋亡显著增加（如图4Bd所示）。计数细胞凋亡数，其统计结果显示：AMD3100、LY294002及AMD3100+LY294002处理72h后，与空白对照组比较，凋亡细胞数增加有统计学差异(*P<001，n=3)（详见表2）。

表1流式细胞仪检测细胞周期结果

组别（groups）G0/G1SG2/M空白对照组（control）441±84396±53163±28AMD3100595±106*308±8596±39LY294002572±91*311±66117±25AMD3100+LY294002667±147**232±32101±18注：各实验组与对照组比较*P＜005,**P＜001。

表2流式细胞仪检测细胞凋亡结果

组别（groups）细胞凋亡率（rateofapoptosis）（%）对照组（control）039±008AMD31003485±666*LY2940023880±869*AMD3100+LY2940028116±1583*注：各实验组与对照组比较*P＜001

3讨论

信号通路与肿瘤发生、发展的关系一直是肿瘤领域研究的热点。大量的研究表明，PI3K/Akt通路的激活与肿瘤的发生和发展有着密切的关系，其机理可能是通过调节p53、p27、p21等蛋白的表达和功能，也参与了对CDK、CKI、intergrin等的调节影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、血管生成、迁移和分化等。阻断PI3K信号通路在肿瘤治疗的研究是近几年肿瘤治疗研究领域的热点［1-3］。近期研究显示，抑制剂在阻断PI3K信号通路的肿瘤血管生成的方面起到了关键作用［4,5］。

本研究选择的人乳腺癌MDA-MB-231细胞系，具有高增殖性，转移能力强的特点。免疫组化检测结果显示，MDA-MB-231细胞能表达CXCR4蛋白和p-AKT蛋白，前者定位于细胞膜上，属于跨膜蛋白受体，后者定位于细胞浆和细胞核中。在此基础上，我们用相应的抑制剂阻断SDF-1/CXCR4-PI3K信号通路，观察其对细胞增殖和凋亡的影响。

研究表明，MDA-MB-231细胞经AMD3100和LY294002分别或共同处理72小时后，与空白对照组比较，p-AKT蛋白表达均明显下调，说明AMD3100能与SDF-1竞争性结合CXCR4，抑制AKT蛋白磷酸化。而LY294002可以透过细胞膜，特异性抑制PI3K，进而抑制Akt磷酸化，使p-Akt的表达下调，从而抑制PI3K/Akt信号转导途径。AMD3100和LY294002这两种抑制剂的作用原理不同，作用部位和方式不同，它们的联合应用可以明显抑制SDF-1/CXCR4-PI3K信号通路，并起协同作用。本研究利用AMD3100和LY294002阻断MDA-MB-231细胞系的SDF-1/CXCR4-PI3K信号通路，结果表明，MDA-MB-231细胞经AMD3100和LY294002分别处理及联合处理24、72h后，随时间的延长各实验组存活细胞数显著减少，两种抑制剂联合应用细胞数减少尤为明显，且出现大量的凋亡细胞。通过MTT细胞增殖实验发现，AMD3100、LY294002及AMD3100+LY294002可明显抑制MDA-MB-231细胞的生长速率，并且24、48、72和96h后MDA-MB-231细胞的存活率逐渐降低，这表明SDF-1/CXCR4-PI3K/Akt信号通路参与了乳腺癌细胞的增殖。另外，软琼脂克隆形成实验结果亦显示，AMD3100、LY294002及AMD3100+LY294002可抑制MDA-MB-231细胞的克隆形成，使克隆体积减小，克隆形成率明显降低，进一步证明了SDF-1/CXCR4-PI3K/Akt信号通路在乳腺癌细胞增殖中的作用。两种抑制剂联合应用比单纯应用更能抑制肿瘤细胞的增殖能力，使细胞活力显著降低，说明两种抑制剂联合应用能起协同作用，有效地抑制乳腺癌细胞的增殖。

细胞凋亡是多细胞生物维持自身稳定的重要机制，可维持组织器官细胞数目恒定及生长的平衡。细胞凋亡在控制细胞增殖、肿瘤发生和生长中起重要作用。我们通过流式细胞术检测MDA-MB-231细胞经AMD3100、LY294002和AMD3100＋LY294002处理后细胞凋亡的变化，结果表明，经AMD3100和LY294002分别作用后72h后，MDA-MB-231细胞凋亡率比对照组显著增加，尤以经AMD3100和LY294002共同作用后，MDA-MB-231细胞凋亡率增加明显。细胞周期检测结果显示，经AMD3100和LY294002分别作用72h后,MDA-MB-231细胞在G0/G1期增多，S及G2/M期细胞数量减少；经AMD3100和LY294002共同作用72h后,MDA-MB-231细胞在G0/G1期显著增多，S及G2/M期细胞数量明显减少。因此我们推论，SDF-1/CXCR4-PI3K/Akt信号通路受到抑制后，MDA-MB-231细胞不能有效地维持细胞增殖周期，而促使更多的细胞进入静止期和蛋白合成前期，同时抑制MDA-MB-231细胞的增殖，促进细胞凋亡。

总之，本实验在体外初步证明，SDF-1/CXCR4-PI3K生物学信号通路可调控肿瘤细胞的增殖与凋亡。其特异性抑制剂在体外可有效抑制乳腺癌细胞的增殖并加速其凋亡，两种抑制剂联合应用能起协同作用，这为临床治疗乳腺癌提供了新的思路和途径。

参考文献

［1］ZhouH,KimYS,PeletierA,etal.EffectsoftheEGFR/HER2kinaseinhibitorGW572016onEGFRandHER2overexpressingbreastcancercelllineproliferation,radiosensitization,andresistance［J］.IntJRadiatOncolBiolPhys,2004,58(2):344352

［2］LinWC,KaoHW,RobinsonD,etal.Tyrosinekinasesandgastriccancer［J］.Oncogene,2000,19(2):56805689

［3］EastyDJ,BennettDC.Proteintyrosinekinasesinmalignantmelanoma［J］.MelanomaRes,2000,10(5):401411

［4］FraserM,LeungBM,YanX,etal.p53isadeterminantofX-linkedinhibitorofapoptosisprotein/Akt-mediatedchemoresistanceinhumanovariancancercells［J］.CancerRes,2003,63(21):70817088

［5］LeonardDS,HillAD,KellyL,etal.Anti-humanepidermalgrowthfactorreceptor2monoclonalantibodytherapyforbreastcancer［J］.BrJSurg,2002,89(3):262271