钩藤药材中钩藤碱与异钩藤碱的含量测定方法

钩藤药材中钩藤碱与异钩藤碱的含量测定方法

陈木水

陈木水

（广州中医药大学第一附属医院药学部广东广州510405）

【摘要】目的研究对传统中药材钩藤中的有效成分钩藤碱和异钩藤碱进行质量控制的方法。方法采用ZORBAX快速分离3.5µm柱，甲醇超声法提取钩藤药材，在流速0.4mL/min，柱温为25℃，检验波长为245nm的条件下对对照品和样品进行测试。结果甲醇超声法提取效果良好，钩藤有效成分钩藤碱和异钩藤碱在24h内可保持稳定，含量测定样品和对照品差异小。结论采用甲醇超声法提取钩藤碱异钩藤碱效果良好，该法测定二者含量可行可用于钩藤的质量控制。

【关键词】钩藤碱异钩藤碱甲醇超声法质量控制

【中图分类号】R927.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）23-0348-02

钩藤为常见中药材，来源于茜草科植物大叶钩藤UncariamacrophyllaWall、毛钩藤UncariahirsuteHavil、华钩藤Uncariasinensis、无柄果钩藤UncariasessilifmctusRoxb的干燥带钩茎枝[1-3]。其原产地有江西、两广、云南、湖南等地，中药学认为其性甘，凉。归肝、心包经。有息风定惊、清热平肝的作用。可用于肝风内动，惊痫抽搐，高热惊厥，感冒夹惊，小儿惊啼，妊娠子痫，头痛眩晕等病症[1-3]。至今为止已鉴别的钩藤中的有效成分包括吲哚类生物碱如钩藤碱(Rhynchophylline),异钩藤碱(Isorhynchophylline)，去氢钩藤碱(Corynoxeine)，异去氢钩藤碱(Socrynoxeine)和三萜类成分如钩藤苷元、长春钩藤苷元等[4-5]。钩藤碱和异钩藤碱具有降血压、抗血小板凝结、抗血栓、抗心律不齐等功效。异钩藤碱还可与扩血管药物合用以增强其降压作用[6]。本实验旨在探讨合适的方法提取、定量鉴定钩藤中的钩藤碱和异钩藤碱为钩藤的质量控制提供依据。

1仪器和材料

1.1仪器

HPLC（Agligent1200），20L超声波清洗仪（上海摩速科学器材有限公司），SartoriusBS224S分析天平（北京Sartorius仪器系统公司），TG18-WS离心机（长沙维尔康湘鹰离心机有限公司）。

1.2材料

钩藤碱对照品（上海融禾科技发展有限公司，批号：2011098761，含量：HPLC≥98%），异钩藤碱对照品（上海融禾科技发展有限公司，批号：2011098763，含量：HPLC≥98%），甲醇（色谱纯，广州艾欣科学仪器有限公司），去离子水（由Milli-QAcademic纯水机制备，上海而立环保科技有限公司），钩藤药材从北京同仁堂药店采购(批次：2010081312658)。

1.3样品制备

将钩藤药材粉碎后过30筛，精密称取10g，纯水浸泡1小时后，加热回流提取45分钟，冷却后过滤，此液为水煎液。取钩藤药材粉碎后过30目筛，精密称取10g，保存在棕色瓶中，加入甲醇，生药浓度约为1：1000，置冰箱中12h后超声30min，过滤，次液为甲醇液。取两液各2ml离心（15，000rpm/min,10min），取上清液用微孔滤膜过滤，保留10μl续滤液测量。

1.4色谱条件

ZORBAX快速分离3.5µm柱（4.6mm内径），流动相：70%甲醇（含0.01mmol/L三乙胺，pH值调为7），流速0.4mL/min，柱温为25℃，检验波长：245nm。

1.5对照品的配置

精密称取钩藤碱和异钩藤碱标准对照品适量，加甲醇配置为每毫升含1.0mg的对照品溶液。

1.6专属性测试

精密吸取对照品、样品10µl,钩藤碱和异钩藤碱的保留时间分别为11.5和12.9min，且两峰分离度好。见附图1。

附图1钩藤药材中钩藤碱（1）、异钩藤碱（2）（a:对照品；b:样品）

1.7线性关系考察

精密吸取钩藤碱、异钩藤碱对照品溶液各100、80、60、40、20、10、5μl依次置于1—7号容量瓶和棕色瓶中。用70%甲醇定容，依次量取10μl上述溶液进行测量，以钩藤碱和异钩藤碱的色谱峰面积为纵坐标Y，对应浓度为横坐标X，绘制线性回归曲线，结果显示钩藤碱在5—20μg/mL范围内线性关系良好，回归方程为：Y=81.2352X-0.0765(r=0.9996)，异钩藤碱在5.5--100μg/mL范围内线性关系良好，回归方程为：Y=91.5642X-0.0256(r=0.9998)。

1.8精密度测定

精密量取钩藤碱和异钩藤碱混合对照品溶液10μl，连续进样5次，测得RSD分别为2.12%和3.01%，证明仪器精密度良好。

1.9检测限和定量限

量取线性项下对照品溶液定量稀释，在信噪比为5：1的条件下，测得钩藤碱和异钩藤碱的检测限为0.31μg/ml,0.45μg/ml，以S/N为10：1测得二者定量下限分别为0.8μg/ml和2.1μg/ml。

1.10重复性和稳定性

取同批钩藤样品10份，按照上述方法配制供试品溶液，去10μl进行测定，其RSD为钩藤碱3.21%，异钩藤碱3.56%。再取同一供试品溶液在0，4，8，12，16，20，24h进行测定，结果为钩藤碱和异钩藤碱的峰面积RSD分别为3.98%，4.21%，说明供试品溶液至少在24h内稳定。

1.11样品测定

取3个批次的药材和对照品，按照甲醇超声法取制备后进行含量测定，结果见附表1。

附表1钩藤碱异钩藤碱含量测定(n=3)

批号钩藤碱%RSD%异钩藤碱%RSD%

201112010.06121.310.04561.78

201112050.08791.230.06431.99

201112210.07541.080.03242.08

对照品0.05431.450.03262.44

2讨论

由于钩藤碱和异钩藤碱为同分异构体，增加了HPLC分离的难度，本试验根据文献资料将三乙胺和pH调为0.01mmol/L和7.0达到了良好的分离效果[1,5]。钩藤碱和异钩藤碱不稳定需要避光冷藏保存，加热对其成分破坏大，本试验中采用甲醇超声法提取有效成分，结果显示重复性好，含量测定样品和对照品差异小，效果良好，故该法可用于钩藤药材的质量控制。

参考文献

[1]张荣,刘睿,刘启德,等.钩藤中钩藤碱、异钩藤碱的提取与含量测定[J].中药新药与临床药理,2009,20(4).

[2]谢笑龙,吴敏,吴芹,等.异钩藤碱对血小板聚集与血栓形成的抑制作用[J].中国药理学通报,2007,23(12).

[3]谢笑龙,吴敏,吴芹,等.异钩藤碱对血小板聚集和血栓形成的影响[J].中国药学杂志,2008,43(4).

[4]王萍,王敏智,王兴.反相HPLC法测定大鼠组织中异钩藤碱含量[J].中国中医药信息杂志,2010,17(3).

[5]李思蒙,侴桂新.钩藤药材中异钩藤碱含量的超高效液相色谱和高效液相色谱法测定[J].时珍国医国药,2010,21(12).

[6]莫志贤,严愉妙,周晓君等.候钩藤总碱含量测定及其药理作用的初步研究[J].时珍国医国药,2011,22(5).