硫磺长期摄入对小鼠生殖毒性的研究

硫磺长期摄入对小鼠生殖毒性的研究

姚海月张月洁陆英贺气志

长沙医学院湖南长沙410219

【摘要】目的：探讨硫磺水悬液对小鼠的生殖毒性和遗传毒性。方法：采用微核实验和精子畸形率实验评价其遗传毒性，将40只小鼠随机分成空白组（0.1ml/10g生理盐水），硫磺染毒低、中、高剂量组（200，400，800mg/L）硫磺水悬液）。雄鼠连续给药60d后处死，取骨髓细胞检测嗜多染红细胞的微核率；取双侧附睾制成精子悬液，计算精子畸形率。雌鼠连续给药14d至受孕后20d母鼠眼球取血检测LH、PRL值。结果：高、中剂量组小鼠嗜多染红细胞的微核率及精子畸形率与空白组比较有显著性差异；高、中雌剂量组激素水平低于空白组；且高剂量组微核率及精子畸形率、雌激素水平与低剂量组差异有统计学意义（P<0.05）；高剂量硫磺可诱发小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率及精子畸形率升高，以及激素水平变化，考虑存在潜在的遗传毒性和生殖。

【关键词】硫磺；慢性毒性；微核；精子畸形；雌激素

硫磺属低毒危险化学品，商品为黄色固体或粉末，有明显气味，能挥发。燃烧时发出青色火焰，伴随燃烧产生二氧化硫气体，其蒸汽及硫磺燃烧后产生的二氧化硫对人体有剧毒。过量硫磺进入肠内大部分会迅速氧化成无毒的硫代物，未被氧化的游离硫化氢，则对机体产生毒害作用。硫化氢是一种强烈的神经毒物，对胃肠粘膜、呼吸道有明显的刺激作用，浓度越高，全身毒性作用越明显。现今市面上有大量用硫磺蒸熏或炮制的食品或药材。由于不法商家为谋取利益滥用、超标使用硫磺，使得本来对人体有益的材料变成伤害人的毒药。因目前国内外已有一些有关用硫磺熏蒸或炮制食品及药材的研究报道，但少有直接利用硫磺进行实验的相关研究报道。为加强硫磺在食品及药材生产过程中的应用监控，基于硫磺毒性对机体的影响，本实验拟从临床医学角度针对于硫磺本身毒性对机体产生慢性毒性并从遗传学角度开展进行。

1实验材料（Materials）

1.1实验动物选用SPF级昆明种小鼠40只，雌雄各半，体重（20±2）g，长沙天勤生物技术有限公司提供；小鼠饲养环境：温度23-28℃，相对湿度70%-80%，自然通风，光照/黑暗各12h，自由摄食，饮水。

1.2仪器高速离心机；光学显微镜；

1.3药品与试剂硫磺粉剂，纯度99%，（商丘市亮峰卫生用品有限公司生产提供批号14041603）；双蒸水长沙医学院实验室制备；姬姆萨（上海试剂三厂）；伊红Y（温州市东升化工试剂厂）；无水甲醇（广州化学试剂厂）；无水乙醇（广州化学试剂厂）；甘油（广州化学试剂厂）；小牛血清（杭州四季清生物工程有限公司）

2方法

2.1硫磺水悬液制备小鼠灌胃前24小时，称取硫磺粉0.2g、0.4g、0.8g，分别与1000ml双蒸水混匀制备成低中高三浓度硫磺水悬液。

2.2动物分组及处理方法

将40只昆明小鼠，按10只为一组，雌雄各半，随机分为4组，一组为空白试验对照组，其余3组为实验组。硫磺粉水悬液，0.1ml/10g等体积灌胃一天一次，雄性灌胃60d，雌性灌胃14d。分别为T0空白对照组等体积蒸馏水、T1低硫磺组（200mg/L）、T2中硫磺组（400mg/L）和T3高硫磺组（800mg/L）。交配前雄鼠连续灌胃60天，交配前雌鼠连续灌胃14天，雌雄鼠按1：1合笼交配，发现阴栓之日定为受孕第“0”天。交配后雄鼠给药至受孕第6天。

2.3测定指标及方法

2.3.1雄鼠精子细胞畸形率：给药染毒60天后颈椎脱臼法处死雄性小鼠，检查测算精子畸形率。

精子计数：颈椎脱臼处死小鼠，取双侧附睾，制成精子悬液。将精子悬液滴在载玻片上，轻轻将悬液推开，自然晾干。经甲醛固定，伊红染色后在光学显微镜下观察精子的形态，每只老鼠观察1000个精子，计算精子畸形率。

2.3.2骨髓微核率：各组小鼠于末次用药2h后处死，迅速取后肢股骨，小牛血清冲洗骨髓腔，过滤后制成涂片，经甲醛固定后吉母萨染色，油镜下观察，每只小鼠计数1000个骨髓嗜多染红细胞中含微核的嗜多染红细胞数，计算微核千分率（‰）。

2.3.3雌鼠激素水平检测：小鼠眼球眶内取血，采集1-2ml的全至血长沙医学院附属第一医院检测垂体泌乳素（PRL）、促黄体生成素（LH）。

统计学分析：数据用x±s表示，均数的比较采用单因素方差分析，率的比较用T检验。用SPSS21.0软件进行统计处理，P<0.05为差异有显著性意义。

3结果

3.1实验动物数量分析纳入的40只昆明小鼠全部进入结果分析，无死亡。

3.2硫磺水悬液对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率及精子畸形率的影响

利用SPSS配对样本T检验（见表1）显示：各剂量组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率均高于对照组，T2组、T3组与对照相比差异有统计学意义，且T3组>T1组差异具有统计意义（P<0.05）；各剂量组精子畸形率均高于对照组，T2组、T3组与对照相比差异有统计学意义，且T3组>T1组差异具有统计意义（P<0.05）。

3.3硫磺水悬液对雌鼠激素水平的影响

利用SPSS配对样本T检验（见表2）显示：T2、T3的LH&PRL值与对照组差异均有意义（P<0.05），且T3组与T1组差异有统计学意义（P<0.05）

4讨论

微核是指位于细胞浆中独立于主核的核小体，主要由外界损害因素作用细胞后，导致细胞染色体丢失或断裂，从而在胞浆中形成单个或数个小核。其形成也是细胞受遗传毒物作用后的一种遗传学终点表现；可以反映出所检测药物对试验动物的遗传毒性，微核试验已成为筛选化学物质遗传毒性快速、敏感的常规方法之一。本实验用硫磺水悬液灌胃小鼠后，各剂量组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率均高于对照组，且高剂量组相较对照组及低剂量组差异有统计学意义（P<0.05），考虑硫磺悬液具有潜在的遗传毒性。

精子畸形是指精子形状改变和畸形精子数量增加。小鼠精子畸形实验是我国对食品、药品、等进行雄性生殖细胞遗传性的安全性评价标准方法。本次研究结果显示各剂量组精子畸形率均高于对照组，且高剂量组精子畸形率相较对照组与低剂量组差异具有统计学意义（P<0.05），表明硫磺悬液对雄性成年小鼠生殖细胞有致突变作用。

垂体泌乳素是垂体分泌的一种蛋白激素，维持女性黄体的功能和促进男性睾酮的合成。过低或过高的泌乳素分泌量都会导致机体的内分泌系统紊乱；PRL的测定可作为评定下丘脑-垂体功能的一项重要指标，以此为基础测定雌鼠垂体泌乳素值来分析胎鼠的着床发育情况及母鼠的生活状态等；促黄体素（LH）又称为促黄体生成素，促使卵巢血流加速，在卵泡素作用的基础上引起卵泡排卵和促进黄体的形成。若排卵期前雌激素分泌不足，则易导致黄体发育不良而过早萎缩，使黄体分泌功能欠佳，孕酮分泌量不足。实验结果显示各剂量组雌鼠LH及PRL值与对照组相比均降低，且高剂量组相较低剂量组差异明显具有统计学意义（P<0.05），体现在胎鼠表型上为体重、身长等低于对照组且差异有统计学意义（P<0.05），证明硫磺在高剂量时影响雌鼠孕激素分泌并造成胎鼠生长情况差异，考虑高剂量的硫磺经口染毒极大可能存在生殖毒性。

参考文献：

[1]刘星，李啸红，陈阳，罗琼，葛晨，王超，黎善铭.续断水提液对小鼠急性毒性和遗传毒性的影响[J].中国实验方剂学杂志，2016，05：160-165.

[2]杨献福，和钰.促黄体生成素及其检测与免疫[J].中国畜牧兽医，2007，12：147-149.

[3]王雄，陈永刚，吴金虎.泌乳素的研究进展[J].医学综述，2012，01：6-10.

[4]张宏，李啸红，黄代荣，曾云，杨俊，王仕辰，王凤宇.罗汉果对雄性小鼠骨髓微核和精子形态的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，28：5249-5252.

[5]贾海梅.镉对大鼠卵巢孕激素合成的影响及其机理研究[D].福建医科大学，2007.

注：项目编号：2015年长沙医学院大学生创新性课题69号