CBS在SHR大鼠延髓腹外侧区的表达及意义

CBS在SHR大鼠延髓腹外侧区的表达及意义

董金虎

董金虎河南省南阳市第一人民医院心内科河南南阳４７３０００

【摘要】目的探讨硫化氢(H２S)合成酶胱硫醚－β－合成酶(CBS)在自发性高血压大鼠(SHR大鼠)延髓外侧区的表达及意义.方法用雄性WKY大鼠作为SHR大鼠同种系正常对照组;免疫印迹方法观察雄性SHR大鼠及雄性WKY大鼠延髓外侧区的CBS表达水平差异.结果CBS在SHR和WKY大鼠中枢延髓腹外侧均有表达(Fig．１．５,Fig．１．６),且１７周SHR大鼠CBS的表达水平在延髓腹外侧低于WKY大鼠(p＜０．０５).结论内源性H２S生成减少可能与原发性高血压的形成有关.【关键词】硫化氢;胱硫醚－β－合成酶;高血压【中图分类号】R７４３．３【文献标识码】B【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－０１３２－０２

内源性硫化氢(hydrogensulfide,H２S)是一种具有臭鸡蛋气味的气体,无色有毒.但是通过近２０年来的研究,研究者发现H２S是人体内继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后发现的第三类气体信号分子[１],通过深入研究发现内源性H２S与多种心血管系统疾病密切相关[２].内源性H２S在人体内主要由胱硫醚－β－合酶(CBS)、胱硫醚－γ－裂解酶(CSE)和半胱氨酸转移酶催化半胱氨酸产生.CBS主要存在于神经系统内,一般认为,延髓是心血管活动的基本中枢,延髓头端腹外侧部是交感缩血管中枢和心交感中枢所在的部位,观察CBS在SHR大鼠延髓外侧区的表达,判断H２S在自发性高血压的中枢效应.本研究旨在探讨硫化氢(H２S)合成酶胱硫醚－β－合成酶(CBS)在自发性高血压大鼠(SHR大鼠)延髓外侧区的表达及意义.

１材料与方法

１．１实验动物与主要试剂２０只清洁级雄性１７周龄自发性高血压大鼠(SHR大鼠)和WKY大鼠２０只,体重２５０－３００g(中科院实验动物中心提供).分为WKY大鼠对照组和SHR大鼠组.２组大鼠分笼喂养,自由饮水和摄食.BCA试剂盒(上海碧云天生物公司),小鼠抗大鼠CBS抗体(Abnova公司).

１．２试验方法免疫印迹实验(Western－blot)２组大鼠快速断头处死,取出延髓外侧区,称重,切小块放入管中,加入蛋白质抽提试剂(２５０mg组织中加入１ml抽提试剂),用匀浆器每次３０秒低速匀浆至组织完全裂解,４℃、１４,０００r/min离心１５分钟后取上清液,按BCA试剂盒操作说明书操作计算出蛋白浓度.使用BioRad电泳装置,分离蛋白,分离后转移至PVDF膜上.膜在５％BSA溶液中室温孵育１小时以封闭膜上的非特异结合.封闭过的膜加入一级抗体４℃过夜,抗原抗体结合.TBST洗膜３次,每次５分钟.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准,室温孵育膜１小时.TBST洗膜３次,每次５分钟.KC化学发光试剂盒中两种试剂等比例混合为反应液.将膜置于反应液中室温孵育３分钟.去除过量的溶液,将膜夹在两塑料薄膜之间,以X光胶片曝光.图片扫描保存为电脑文件,并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化.所测蛋白的灰度值除以内参GAPDF的灰度值表示CBS含量.

１．３统计学处理采用SPSSl３．０统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(`x??x±s)表示,组间采用单因素方差分析及q检验进行差异显著性分析,P＜０．０５为差异有统计学意义.２结果结果显示:CBS在SHR和WKY大鼠中枢延髓腹外侧均有表达(Fig．１．５,Fig．１．６),且１７周SHR大鼠CBS的表达水平在延髓腹外侧低于WKY大鼠(p０５)差异有统计学意义.

３讨论现代研究表明,CBS和CSE的表达具有组织特异性.中枢神经系统内,内源性H２S主要由CBS催化生成.实验研究证实,脑组织中生成的H２S可以被CBS抑制剂所阻断,而不被CSE抑制剂所阻断,内源性H２S在CBS缺乏的小鼠中表达明显减少[３].内源性H２S与NO和CO一样,是一种小分子物质,能自由穿越膜结构,不依赖与膜受体发挥作用.H２S在体内有两种存在形式,一种是以未溶解的形式存在,占１/３,另一种是以NaHS的形式存在,占２/３,两种存在形式保持动态平衡.其分子特性决定了H２S能在多环节上参与调控心血管作用.内源性H２S通过能舒张血管平滑肌、抑制血管重塑、减少血管炎性反应和对心脏的负性肌力及负性心率作用,降低血压及延缓高血压的进展[４].近年来有文献报道内源性H２S在大脑对中枢心血管系统有重要的调节作用.研究已证实延髓头端腹外侧部是重要的心血管中枢,它通过整合来自下丘脑室旁核、延髓孤束核等心血管相关核团的投射,是中枢神经系统对心血管活动调节的最后通路[５－７].我们研究结果显示,CBS在SHR和WKY大鼠中枢延髓腹外侧均有表达,且１７周SHR大鼠CBS的表达水平在延髓腹外侧低于WKY大鼠(p＜０．０５).说明内源性H２S生成减少可能与原发性高血压的形成有关.综上所述,H２S作为第三种气体信号分子参与了心血管疾病的多个病理生理过程,但其参与原发性高血压发病的作用机制仍不完全清楚.随着对内源性H２S不断研究,其潜在的心血管疾病的治疗作用将是未来研究重点,开发H２S的药用价值,具有重要的理论及临床意义.参考文献[１]Wang,R．,Two＇scompany,three＇sacrowd:canH２SbethethirdendogＧ[enousgaseoustransmitter[J]?FASEBJ,２００２．１６(１３):１７９２－１７９８．２]Dawe,G．S,etal．HydrogensulphideinthehypothalamuscausesanATP－sensitiveK＋channel－dependentdecreaseinbloodpressureinfreely[movingrats[J]．Neuroscience,２００８．１５２(１):１６９－１７７．３]EtoK,KimuraH．Anovelenhancingmechanismforhydrogensulfideproducingactivityofcystathionineβ－synthase[J]．JBiolChem,２００２,[２７７:４２６８０－４２６８５．４]柳子静,钟光珍,高明明．新型气体信号分子硫化氢与高血压发病[J]．国际心血管病杂志,２０１０,３７(１):４９－５２．[５]于云海,马红,曹银祥等．硫化氢对SHR大鼠的中枢心血管效应及其机制探讨[J]．中国分子心脏病学杂志,２０１１,１１(４):２３５－２４０．[６]Guyenet,P．G．,Thesympatheticcontrolofbloodpressure[J]．NatRev[Neurosci,２００６．７(５):３３５－３４６．７]Sved,A．F．,S．ItoandJ．C．Sved,Brainstemmechanismsofhypertension:roleoftherostralventrolateralmedulla[J]．CurrHypertensRep,２００３．５(３):２６２－２６８．