荧光示踪剂研究逆行岛状皮瓣静脉回流的效果分析

荧光示踪剂研究逆行岛状皮瓣静脉回流的效果分析

荆志振1宋洁富1胡伟1陈斌1张世民2

荆志振1宋洁富1胡伟1陈斌1张世民2

(1.山西省人民医院骨科太原030012；2.同济大学附属同济医院)

【摘要】目的：比较研究三种荧光剂在逆行岛状皮瓣静脉回流的效果，以寻找最佳的研究方法。方法：分别取15只新西兰兔耳静脉血各0.1ml，分离红细胞、FITC标记及检测。45只新西兰大白兔后肢建立隐动静脉逆行岛状皮瓣模型。每只动物将一侧后肢随机设定为实验侧，对侧生成相同的皮瓣作为对照，对照侧不注入荧光剂。实验动物按照注入的三种荧光剂不同分成三组，再按注入的途径不同分三亚组。分别取三种荧光剂，通过皮瓣近端给入。在体视荧光显微镜下大体观察荧光的扩散，动脉、静脉亚组5s后，皮下亚组10s后，取下皮瓣做连续两张冰冻切片，分析荧光在血管蒂部的分布。结果：FITC标记的红细胞荧光强度均匀，可以用于示踪研究。荧光素钠在血管及其周围组织均匀分布；FITC标记的多聚糖主要分布在蒂部的血管，血管周围组织有弱的荧光分布；FITC标记的红细胞分布在蒂部的血管。结论：FITC标记的红细胞是研究皮瓣静脉回流的最佳选择，荧光剂可选择性的通过动脉、静脉和皮下三种途径注入。

【关键词】逆行岛状皮瓣；静脉回流；荧光示踪剂

【中图分类号】R622【文献标识码】A【文章编号】1008-6455（2011）02-0284-02

逆行岛状皮瓣是以知名动脉及其伴行静脉为蒂,且血管蒂部动脉及静脉血流方向均与正常相反的岛状皮瓣。自1976年Bostwick等[1]首先报道了逆行颞浅动脉岛状皮瓣后，已经被广泛应用于肢体创伤的修复和重建，但由于在蒂部，静脉要逆瓣膜而回流，静脉回流的具体机制目前仍不明确。我们的实验在建立逆行岛状皮瓣的基础上，探索使用不同的荧光剂研究静脉回流的可行性及效果，为进一步研究静脉回流提供方法依据。

1材料与方法

1.1实验动物、试剂及仪器：6月龄健康新西兰大白兔45只，体重2.5～3.0kg，雌雄不限。异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)；FITC标记的多聚糖(分子量500，000)；荧光素钠（分子量37628）；FACSCalibur流式细胞仪；冰冻切片机、体视荧光显微镜；荧光显微镜、倒置荧光显微镜；微量注射器。

1.2红细胞分离、标记和检测:采用Butcher等[2]方法标记红细胞。取15只新西兰大白兔以2%戊巴比妥钠2mL/kg耳缘静脉麻醉后，每只兔耳静脉取血0.1mL，PBS（pH7.4）稀释至0.2mL。于离心半径15.2cm，2000r/m离心5min，分离红细胞。PBS洗涤细胞2次，重悬红细胞至原体积。取5μL红细胞悬液行红细胞计数，红细胞为（2.5～3.0）×106/μL。取20μLFITC（1μg/μL）加入红细胞悬液中，于37℃孵育1h。红细胞悬液同上法再次离心后，PBS洗涤2次，以洗掉未标记的游离FITC，重悬红细胞至原体积。

分别取红细胞悬液5μL，置于含1mLPBS的2个试管中，其中一试管中的红细胞悬液置于倒置荧光显微镜下观察被标记的红细胞形态；另一试管中的红细胞悬液，利用FACSCalibur流式细胞仪CELLQuest分析软件计数10000个红细胞，检测荧光标记红细胞的阳性率及荧光标记强度，以荧光强度≥103定为阳性。

1.3动物模型制备及分组:将45只新西兰大白兔同上法麻醉，两侧后肢内侧剪毛，8%硫化钠脱毛。仰卧固定，于大腿上止血带，常规消毒铺巾。随机选择一侧为实验侧，皮瓣制备后注射示踪剂；对侧生成相同的皮瓣作为对照，不注射示踪剂。参照张世民等[3]方法在动物双侧后肢的内侧分别建立逆行岛状皮瓣模型，切取皮瓣面积4cm×3cm，血管蒂长3cm。逆向法掀起隐动静脉血管束逆行岛状筋膜皮瓣，45只动物后肢共制备90个皮瓣。实验动物按照注入的示踪剂不同分成三组，即荧光素钠组、FITC标记的多聚糖组和FITC标记的红细胞组，每组15只；再按示踪剂给入途径的不同，分为对应的动脉、静脉和皮下三个亚组，每亚组5只。其中动脉亚组在皮瓣中部把动脉结扎切断，避免示踪剂通过动脉直接回流到血管蒂。在皮瓣和组织床之间用乳胶膜隔开，使皮瓣仅通过血管蒂与肢体相连，生成30min后，皮瓣的渗血减少，微循环处于新的动态平衡中，此时注入示踪剂。用微量注射器分别抽取5μL已标记的红细胞悬液、5%荧光素钠或5%FITC标记的多聚糖，在体视荧光显微镜观察下，分别通过皮瓣近端的隐动脉、静脉或皮下注入，动脉、静脉亚组5s后，皮下亚组10s后，取下各组皮瓣，立即冰冻。

1.4观察指标

1.4.1体视荧光显微镜观察:在体视荧光显微镜下，大体观察荧光在皮瓣的扩散方向和速度，记录荧光到达蒂部的时间。

1.4.2组织学观察:取冰冻的皮瓣蒂部行冰冻切片，采用连续的两张冰冻切片（5μm～7μm），其中一张行HE染色，另一张不染色直接压片。经苏木精-伊红染色的切片，在显微镜下观察，确定蒂部血管的分布；未经染色的切片在荧光显微镜下观察，记录荧光在蒂部的分布。由于连续的两张切片厚5μm～7μm，切片上的组织结构基本相同，血管分布也类似。比较两张切片，可以判断荧光出现的部位和结构。比较三种荧光示踪剂在皮瓣蒂部分布的差异，分析用荧光剂研究皮瓣静脉回流的可行性和效果。

2结果

2.1标记红细胞的测定:倒置荧光显微镜观察FITC标记的红细胞，在蓝光激发下呈现均匀分布的绿色荧光，荧光强度均匀，稳定，观察2min，荧光没有明显变化，可以用作示踪研究。应用FACSCalibur流式细胞仪CELLQuest分析软件分析FITC标记的红细胞的阳性率和荧光强度。荧光标记红细胞的阳性率在99%以上，荧光强度均≥103。

2.2大体观察:在体视荧光显微镜观察下，荧光剂注入动脉或静脉后，荧光在皮瓣由瓣部向蒂部方向迅速扩散；注入皮下后，荧光由瓣部向蒂部方向扩散速度缓慢。预实验发现，在体视荧光显微镜下，动脉、静脉亚组在10s后，皮下亚组在20s后，在蒂部尚看不到荧光。但取相同时间的皮瓣蒂部进行冰冻切片观察，在实验组和对照组都出现荧光。预实验还发现，动脉、静脉亚组在5s以内，皮下亚组10s以内，冰冻切片显示，虽实验组蒂部出现荧光，但对照组皮瓣蒂部尚未见到荧光。

2.3荧光在蒂部的分布特点（组织学观察）:通过三种途径注入荧光剂后，同一种荧光剂在蒂部有相同的荧光分布。荧光素钠组，荧光在皮瓣蒂部弥漫分布，除了分布在蒂部的血管，在血管周围的组织也均匀分布，以隐动脉的内外膜和隐静脉壁荧光强度最高；FITC标记的多聚糖组，荧光主要分布在蒂部的隐动脉壁、隐静脉壁和大隐静脉壁，在紧靠血管周围的组织内有弱的荧光，周围组织内未见荧光，其中以隐动脉的内外膜和隐静脉壁荧光强度最高；FITC标记的红细胞组，荧光分布在隐动脉的内外膜、隐静脉壁和大隐静脉壁，静脉腔内未见荧光，血管周围组织内也未见荧光（图1）。通过皮下注入时，荧光剂通过局部毛细血管吸收回流到蒂部，在短时间内吸收的数量有限，在蒂部荧光相对较弱。

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图1荧光剂在实验组血管蒂分布比较（荧光显微镜×20）

NaFL（荧光素钠）组：荧光除了分布在血管外，在周围组织均匀分布。FITC-DEXTRAN（FITC标记的多聚糖）组：荧光主要分布在血管壁，紧邻血管的周围组织有弱的荧光。FITC-RBCs(FITC标记的红细胞)组：荧光分布在血管壁，周围组织和静脉腔内未见荧光。（A动脉图；V静脉图；动脉内膜↑；动脉外膜；静脉壁；静脉腔）

3讨论

逆行岛状皮瓣静脉回流有“迷宫式回流”和“瓣膜失效回流”两种理论,但具体的回流途径仍不明确。为研究静脉回流的规律，Lin等[4]和Nakajima等[5]分别通过静脉造影的方法，把造影剂注入皮瓣近端静脉腔，通过观察造影剂的流向来推测静脉回流的途径。孙博等[6]通过墨汁结合造影研究静脉回流，提出了逆行岛状皮瓣静脉回流的迷宫途径。用造影剂研究静脉回流只能用肉眼作大体观察，难以观察血管内或小血管的细微变化，也就不能得出静脉回流的全貌；并且仅通过静脉逆行造影，也不能客观全面反映静脉回流的真实情况。放射性微球[7,8]被用来研究皮瓣的微循环，特点是适合于定性和定量研究，不宜做细致的定位研究，因此不适合作为示踪剂研究静脉回流。

荧光剂被广泛的应用于研究皮瓣的动脉血供和微循环变化，特点是荧光剂进入皮瓣后，通过激发光可以使荧光剂发出特殊的荧光，再通过荧光显微镜就可以观察到荧光的分布，在显微镜下，既可以进行低倍的大体观察，也可以进行高倍的微观研究，这是它比用造影剂的优越之处。荧光素钠[9,10]、FITC标记的多聚糖[11,12]和FITC标记的红细胞[13,14]是常用的研究微循环的荧光示踪剂，但尚未用于研究静脉回流。荧光素钠的分子式是C20H10Na2O5，分子量为376.28，是小分子的荧光示踪剂；FITC标记的多聚糖分子量是500000，是大分子的荧光示踪剂，很少扩散到毛细血管外；FITC标记的红细胞的最大激发波长和最大发射波长与FITC相似，FITC负载在红细胞上，而红细胞正常不会扩散到毛细血管外，利用红细胞的这个特点，观察微循环和血管的分布。Butcher和Weissman[3]用FITC标记红细胞，证明红细胞标记的FITC不会脱落或者转移到其它细胞。本实验中红细胞的标记效率和强度高，标记后荧光稳定，这些特性使得标记的红细胞适合于示踪研究。

在实验中，首先在兔后肢建立隐动静脉逆行岛状皮瓣模型，荧光剂分别通过逆行岛状皮瓣近端隐动脉、隐静脉和血管周围皮下注入。为预防注射过程对实验结果的影响，尽量减少注射的剂量，荧光剂的剂量控制在5μL。其中动脉注入组，在皮瓣的中部把隐动脉结扎切断，防止荧光剂通过动脉干直接回流到蒂部。静脉注入组由于瓣膜的存在，以往实验报道在正常压力造影剂不会逆向回流，在高压下才有少量回流[15]。我们在实验中用微量注射器注入5μL荧光剂，并不会因注射而产生高压，也就不会影响皮瓣静脉的回流。由于皮瓣生成后，逆行岛状皮瓣的近端血管已经切断，皮瓣的血循环的动力来自蒂部的动脉血供，因此通过逆行岛状皮瓣的近端血管注入的荧光剂不能直接通过动脉回流到蒂部，在蒂部血流动力的推动下，在皮瓣局部扩散到毛细血管，通过静脉回流到蒂部。

预实验显示，在皮瓣近端通过静脉和动脉注入荧光剂10s后，通过皮下注入荧光剂20s后，在体视荧光显微镜下没有观察到有荧光出现，但取相同时间的皮瓣蒂部进行冰冻切片观察，在实验组和对照组都出现荧光。可能是早期到达蒂部的荧光量少，在体视荧光显微镜下未能显示，而对照组皮瓣蒂部出现荧光说明荧光剂已经通过体循环到达皮瓣蒂部。进一步的预实验证实，动脉、静脉亚组在5s以内，皮下亚组10s以内，冰冻切片显示，虽实验组蒂部出现荧光，但对照组皮瓣蒂部尚未见到荧光。提示实验组皮瓣蒂部的荧光是通过静脉回流到达的，通过体循环的荧光尚未返回到皮瓣，这时取下皮瓣冰冻切片，可以通过分析蒂部的荧光分布来推测静脉回流的途径。

实验发现同一种荧光剂在蒂部有相同的荧光分布。荧光素钠在蒂部弥漫存在，在血管外的组织内也有强的荧光分布，原因是荧光素钠属于小分子量物质，在毛细血管和组织间可以自由扩散，这种荧光的弥漫分布难以通过荧光来判断静脉的回流方式，因此荧光素钠不适于研究静脉回流。FITC标记的多聚糖属于大分子量物质，一般仅有少量渗到血管外。实验中FITC标记的多聚糖组，荧光主要分布在血管，紧邻血管外的组织有弱的荧光分布，说明荧光的分布基本反映回流的血液在血管的分布，可以用来研究静脉回流。FITC标记的红细胞组，荧光出现在血管分布的区域，血管外的组织未见荧光分布。因FITC标记在红细胞，荧光存在的部位反映的就是红细胞分布的区域，而在正常血管，红细胞是不会扩散到毛细血管外。在皮瓣蒂部血流动力推动下，红细胞在静脉血管内由近端向远端回流，红细胞回流的轨迹就反映了静脉回流的通路，通过分析FITC标记的红细胞在血管蒂部的分布规律，可以判断静脉回流的途径。实验中通过动脉、静脉和皮下三种途径注入荧光剂，在蒂部荧光的分布是相同的，说明三种方式都可以用来研究静脉回流，皮下注入的方法简单，容易操作，但注入的部位和方向难以精确控制，适合于定性研究，动脉和静脉途径解剖定位准确，适合于定性和定量研究。实验结果表明，在逆行岛状皮瓣生成的早期，静脉血是通过血管壁自身的营养血管的伴行静脉回流，血管腔未见有荧光分布。本实验结果和Nakajima[5]用静脉造影的结论一致，再次提示早期静脉是通过“迷宫式回流”实现的。

我们的实验表明，荧光剂可以用来研究皮瓣的静脉回流，FITC标记的红细胞是研究静脉回流的最佳选择。由于仅观察一个循环周期内荧光在蒂部的分布，且血液循环的周期短，得到的荧光分布规律尚不充分，逆行岛状皮瓣的静脉回流规律尚需进一步研究。

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