Smads蛋白在日本血吸虫性肝纤维化小鼠体内的表达

Smads蛋白在日本血吸虫性肝纤维化小鼠体内的表达

王淑云

Smads蛋白在日本血吸虫性肝纤维化小鼠体内的表达

王淑云(哈尔滨市香坊区哈纺社区卫生服务站黑龙江哈尔滨150039)

【中图分类号】R541.7+1【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2009)21-0165-02

【关键词】日本血吸虫病;肝纤维化;转化生长因子β1;Smad;

Smad蛋白作为转化生长因子β（TGF-β）受体下游迄今发现的惟一底物，对TGF-β信号传导具有重要作用，而Smad蛋白在日本血吸虫肝纤维化形成过程中的作用机理尚不清楚。为此，本研究动态观察Smads蛋白在日本血吸虫感染小鼠形成肝纤维化过程中的表达，以期揭示其在日本血吸虫病性肝纤维化发病过程中的作用。

材料与方法

1动物模型构建

通过腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴（20±1）条[1]。于感染后8、12、16、24周分别处死小鼠8只、8只、8只和10只。所取肝组织置入常规10％福尔马林固定液中，用于苏木素-伊红(HE)染色和天狼猩红染色，测定血吸虫虫卵肉芽肿大小，判断肝纤维化程度；免疫组织化学染色观察Smads蛋白的表达部位，并利用图像分析系统对所表达蛋白进行半定量分析。

2病理学检查

2.1染色方法HE染色：用于判断小鼠感染日本血吸虫尾蚴后，形成虫卵肉芽肿的面积，用测微量器在低倍镜下（×100）测定单个血吸虫虫卵肉芽肿的面积（最大横径×最大纵径，单位mm2），每份标本随机测量5个虫卵肉芽肿，求平均值。天狼猩红染色：用于判断小鼠感染日本血吸虫尾蚴后，形成肝纤维化程度。肝纤维化程度判断标准[2]：

2.2免疫组织化学检测（EnVision法）

3.统计分析

实验数据以均数±标准差（x±SD）表示，利用SPSS11.0统计软件，进行单因素方差分析（One-WayANOVA），独立样本t检验，并利用Graphpadprism3.0作图。

结果

1.日本血吸虫尾蚴感染小鼠形成肝纤维化过程中，肝纤维化程度变化正常BALB/c小鼠汇管区及中央静脉管壁可见少许胶原纤维。感染8周后，虫卵肉芽肿周围出现胶原纤维沉积，随感染时间延长，胶原沉积量增加，并向肝小叶内延伸，在感染24周后，胶原沉积量达到高峰。

2.日本血吸虫尾蚴感染小鼠形成肝纤维化过程中Smad2/3、Smad4和Smad7在小鼠肝组织中的表达正常小鼠肝组织的肝窦区可见呈低水平表达的Smad2/3蛋白，感染8周后，虫卵肉芽肿形成，虫卵肉芽肿周围的细胞的胞浆和胞核内呈棕色表达，肝窦有一定程度的扩张，感染12周时，虫卵肉芽肿周围和肝窦处Smad2/3表达增强，而在感染16周时，表达较12周有所减弱，但在感染24周时，表达再次增强。

Smad7在正常小鼠肝组织的肝窦区呈低水平表达。感染8周时，在虫卵肉芽肿周围可见散在的胞浆内呈现阳性表达细胞，肝窦区表达不明显，感染12周时，Smad7的表达弱，在虫卵肉芽肿周围阳性表达面积明显减少，肝窦区表达与感染8周组比较无明显差异，随着感染继续发展，Smad7的表达无明显变化，表达水平持续在感染12周时的水平。

讨论

日本血吸虫感染模型与人类日本血吸虫病患者具有相似性[3]，因而，建立此模型有利于研究人类日本血吸虫病的发病机制，同时亦为肝纤维化的研究提供了较好的模型，迄今人们已经利用此模型进行了各种相应研究[4-6]。

感染日本血吸虫的小鼠对虫卵肉芽肿形成应答是随着感染过程的延长而减弱的，其体积和所含细胞总数也是随着时间的推移而逐渐缩小和减少。可能机制是早期Th细胞反应活跃而后期炎症反应受到抑制性T细胞作用而导致炎症反应减弱。

小鼠感染日本血吸虫尾蚴8周时，虫卵肉芽肿面积达到高峰因而属于急性期，此时虫卵肉芽肿周围所产生的胶原是由于机体对炎症反应的一种反馈修复过程，其来源可能是肉芽肿周围受到炎症刺激活化的肝星状细胞（HSC）。我们曾利用透射电镜观察了小鼠肝组织中HSC的演变过程，发现感染8周时肌成纤维细胞数量增多，脂滴进一步减少。随着虫卵肉芽肿周围细胞成分的改变，成纤维细胞增加，HSC通过旁分泌效应不断活化增殖，使得肉芽肿周围胶原含量不断增加，其中以HSC的旁分泌效应更为重要，因为通过检测α-SMA在小鼠肝组织中的表达，发现随疾病进展，HSC活化数量逐渐增加，因此，感染24周后，小鼠肝纤维化程度达到峰值。

在BALB/c小鼠感染日本血吸虫尾蚴形成肝纤维化的过程中，TGF-β1的作用在我们以往的研究中已经得到认可。Smads蛋白家族是将TGF-β与其受体结合后产生的信号从胞质传导到细胞核内的中介分子，是一个在脊椎动物、昆虫和线虫内发现的转录因子家族，它是迄今为止惟一已被证明的TGF-β受体作用的底物。为此，我们动态观察了参与介导的TGF-β的信号传导中三类Smad蛋白：受体调节型Smads（Smad2和Smad3）、通用调节型Smad(Smad4)和抑制型或拮抗型Smads(Smad7)的表达部位和表达量的动态变化。

多项研究表明，受体调节型Smad2和Smad3在肝纤维化中均具有重要作用，因而本文将Smad2和Smad3作为整体进行研究。在感染8周时，小鼠肝脏处于急性感染期，TGF-β信号活化以诱导炎症反应。有研究发现TGF-β信号活化后，通过泛素化蛋白酶系统快速降解癌蛋白SnoN,而SnoN主要降解R-Smad的酶，因而，R-Smad表达增强，至感染12周时，炎症反应减弱，肝脏修复过程增强，HSC活化，在TGF-β自分泌和旁分泌共同作用下，使R-Smad表达持续增强，但在感染16周时，R-Smad表达下降至感染8周时的水平，至感染24周时，R-Smad表达水平恢复至感染12周时水平，R-Smad的这种表达变化可能与纤维化形成即是组织病理学的一种修复，同时又是疾病进一步向硬化发展的必经之路有关，也就是说，如果在感染16周时，给与祛除病因的治疗，肝纤维化极有可能逆转。

研究显示Smad4在正常肝组织中无明显表达，感染8周~感染24周的过程中，虽然均高于正常组织，但呈低水平表达，并且表达程度持续在感染8周水平，并未随感染时间的延长而变化。结合Smad4的生物学效应，提示Smad4可能对肝纤维化形成无明显作用。

Smad7的转录过程是由Smad3和Smad4复合物直接结合到Smad7启动子而启动的，而合成的Smad7通过负反馈机制抑制上述信号传导，从而减少Smad7的生成以及TGF-β1介导的生物学效应。本研究发现，在感染8周时，Smad7表达水平升高，但随着感染时间的延长，其表达水平未有明显变化，维持在感染8周时的水平，提示Smad7的低水平表达，降低了对TGF-β1生物学效应的拮抗性，从而促进了小鼠肝纤维化的进展。

上述研究提示，在小鼠形成肝纤维化过程中，Smad2/3具有促进作用，而Smad4和Smad7不具有促进作用。

参考文献

[1]樊中丽,杜幼芹,望西玉.日本血吸虫尾蚴不同途径感染小鼠的比较，热带医学杂志，2001，1（2），151.

[2]陈峰,蔡卫民,陈智,等.日本血吸虫病兔肝纤维化胶原合成与降解转录水平的研究.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2001,19(2):76-79.

[3]KresinaTF,HeQ,DegliespostiES,etal.HepaticfibrosisandgeneexpressionchangesinducedbypraziquanteltreatmentduringimmunemodulationofSchistosomajaponicuminfection.Parasitology,1993,107:397-404.

[4]季曼珺，蔡晓萍,苏川,等.干扰素对感染日本血吸虫小鼠GTP表达的影响.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2004,2(1):29-32.

[5]姚万红,陈静卿,杨孟祥,等.日本血吸虫感染小鼠肝脏成纤维细胞的培养观察.湖北医科大学学报,1999,20(1):21-23

[6]夏超明,龚唯,骆伟,等.日本血吸虫感染小鼠肝肉芽肿与Thl／Th2细胞因子水平的动态变化.复旦学报(医学科学版),2001,28(1):39-42