p38MAPK阻滞剂对百草枯中毒急性肺损伤中TNF-α的影响

p38MAPK阻滞剂对百草枯中毒急性肺损伤中TNF-α的影响

周志兵张剑锋（通讯作者）向沥李霁罗毅丰

（广西壮族自治区广西医科大学第二附属医院急诊科广西南宁530007）

【摘要】目的：探讨p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）在百草枯中毒急性肺损伤中对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的影响。方法：36只SD大鼠按随机数字法分为生理盐水组（NS组）、PQ中毒组（PQ组）、阻滞剂干预组（PQ+SB组），每组各12只，每组再从中各取第1天和第3天6只样本检测，通过观察肺组织病理学变化、肺泡灌洗液中炎症介质TNF-α变化，qRT-PCR法检测各组大鼠肺组织中TNF-α和p38MAPKmRNA表达变化，以此来寻找环境压力应激反应蛋白p38MAPK与肺组织炎症反应的相关性。结果：同一时间点的PQ组肺泡灌洗液中的TNF-α蛋白表达量显著高于NS组（P＜0.05），而同一时间点PQ+SB组较PQ组肺泡灌洗液中的TNF-α蛋白表达量在第3天下降（P＜0.05）。同一时间点的PQ组TNF-α和p38MAPK的mRNA表达量显著高于NS组（P＜0.05），同一时间点PQ+SB组较PQ组表达量下降（P＜0.05）。而PQ组内不同时间点的肺组织中的TNF-α和p38MAPKmRNA随时间增高（P＜0.05）;但PQ+SB组的TNF-αmRNA则无显著差异（P＞0.05）；肺组织病理学变化也显示同一时间点PQ组较NS组病理损伤明显，而PQ＋SB组较PQ组病理损伤减少。结论：p38MAPK抑制剂SB203580能够降低百草枯中毒大鼠急性肺损伤时的炎症介质TNF-α的表达，改善肺组织的炎症反应。

【关键词】p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）；百草枯；急性肺损伤

【中图分类号】R139+.3【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2019）12-0052-03

Effectofp38MAPKblockeronTNF-αinacutelunginjuryinducedbyparaquatpoisoning

ZhouZhibing,ZhangJianfeng(Correspondingauthor),XiangLi,LiWen,LuoYifeng.

EmergencyDepartment,theSecondAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530007,China

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectofp38mitogen-activatedproteinkinase(p38MAPK)ontumornecrosisfactor-α(TNF-α)inacutelunginjuryinducedbyparaquatpoisoning.MethodsThirty-sixSDratswererandomlypidedintonormalsalinegroup(NSgroup),PQpoisoninggroup(PQgroup)andblockerinterventiongroup(PQ+SBgroup),with12ratsineachgroup.Sixsamplesweretakenonday1andday3.ThepathologicalchangesoflungtissueandthechangesofinflammatorymediatorTNF-αinalveolarlavagefluidwereobserved.qRT-PCRwasusedtodetectTNF-αandp38MAPKmRNAinlungtissueofeachgroup.Theexpressionchangewereusedtofindcorrelationsbetweentheenvironmentalstress-stressproteinp38MAPKandlungtissueinflammation.ResultsTheexpressionofTNF-αproteininthealveolarlavagefluidofthePQgrouppointwassignificantlyhigherthanthatoftheNSgroupatthesametimepoint(P＜0.05).TheexpressionofTNF-αproteininthealveolarlavagefluidofthePQ+SBgroupcomparedwiththePQgroupatthethirddayandtheamountofexpressiondecreased(P＜0.05).ThemRNAexpressionlevelsofTNF-αandp38MAPKinPQgroupweresignificantlyhigherthanthoseinNSgroupatthesametimepoint(P＜0.05).Atthesametimepoint,theexpressionofPQ+SBgroupwaslowerthanthatofPQgroup(P＜0.05).TheTNF-αandp38MAPKmRNAinlungtissueatdifferenttimepointsinPQinternalgroupincreasedwithtime(P＜0.05),buttherewasnosignificantdifferenceinthemRNAexpressionlevelsofTNF-αinPQ+SBinternalgroupatthedifferenttimepoint(P＞0.05).PathologicalchangesoflungtissuealsoshowedthatthePQgrouphadmoreobviouspathologicaldamagethantheNSgroupatthesametimepoint,whilethePQ+SBgrouphadlesspathologicaldamagethanthePQgroupatthesametimepoint.Conclusionp38MAPKinhibitorSB203580canreducetheexpressionofinflammatorymediatorTNF-αandimprovetheinflammatoryresponseoflungtissueinratswithacutelunginjuryinducedbyparaquat.

【Keywords】p38mitogen-activatedproteinkinase(p38MAPK);Tumornecrosisfactor-α(TNF-α);Paraquatpoisoning;Acutelunginjury

百草枯（paraquatpoisoning，PQ）是民间常用的廉价除草剂，除草效果好而被广泛应用，因此也成为了急诊病人常见的中毒原因之一[1]。既往研究发现，PQ中毒的病人早期即可发现肺组织的弥漫性炎症反应，以急性肺损伤病理变现为主，出现上皮细胞损伤，肺泡内的水肿和出血，大量的炎性细胞浸润，晚期导致以肺损伤为主的多器官功能障碍综合征[2]。百草枯中毒救治成功率低，致死率高达60%～90%。目前关于百草枯中毒的机制尚不明确，研究表明炎症反应失衡以及氧化应激是百草枯中毒的重要机制，本课题组前期研究发现肿瘤坏死因子TNF-α作为重要的炎症介质在百草枯中毒大鼠中是增高的[3]。p38属于MAPK家族中的一员，它作为上游的环境压力应激反应蛋白而能影响TNF-α的表达，关于p38MAPK阻滞剂在百草枯中毒急性肺损伤大鼠中对TNF-α的影响的报导罕见，本研究将以百草枯灌胃来制作百草枯中毒急性肺损伤大鼠模型，应用p38MAPK阻滞剂SB203580干预后，观察肺组织中TNF-α的变化。

1.资料与方法

1.1实验动物

健康成年SPF级雄性SD大鼠36只，体重200～250g，由广西医科大学动物中心提供，动物使用许可证：SYXK桂2014-0003。饲养温度（20±2）℃，自由进水，普通饲料喂养。

1.2主要试剂、药品和仪器

二氯百草枯结晶体（Sigma公司，美国），p38MAPK阻滞剂SB203580，RNA保存液，RNA提取试剂盒，逆转录试剂盒购于TaKaRa公司，ELISA试剂盒购于华美公司，目的基因引物序列设计合成由南宁科迪公司完成。目的基因碱基序列：β-actin上游引物5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游引物5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'；TNF-α上游引物5'-GGCGTGTTCATCCGTTCTC-3'，下游引物为5'-CTTCAGCGTCTCGTGTGTTTCT-3'；p38MAPK上游引物5'-GTGTCGGTGATGTCAGATGG-3'，下游引物：5'-CAGTATGCAGTCCAGCTCCA-3'。病理图像分析系统（Leica公司，德国）。

1.3方法

1.3.1模型制作与分组将36只大鼠按照随机数字法分成3组，其中生理盐水对照组（NS组）12只，百草枯模型组（PQ组）12只，p38MAPK阻滞剂干预组（PQ＋SB组）12只。PQ组和PQ＋SB组均给予100mg/kg的百草枯一次性灌胃；NS组给予大鼠与百草枯等量的生理盐水灌胃。p38MAPK阻滞剂组在灌胃后立即给予10mg/kg/天SB203580腹腔注射，并每24h重复给予SB203580一次，分别于灌胃后1d、3d后处死并留取标本，本实验动物处置方法符合动物伦理学标准。

1.3.2标本采集10%水合氯醛以0.03ml/kg进行腹腔注射麻醉，打开腹腔，腹主动脉放血处死，剖开颈部皮肤暴露气管，同时开胸暴露心肺及大血管，结扎左侧肺门以后使用10ml注射器吸取PBS缓冲液扎入右心室从而灌注冲洗肺中血液。取以下样本：①结扎左主支气管，行支气管肺泡灌洗（BALF），收集灌洗液于2000rpm离心15min，留取上清，并分装入1.5mlEP管内置于-80℃冰箱中保存备用。②取右下肺用RNA保存液畳于-20℃摄氏度冰箱保存备用，待做Real-timePCR检测，余下肺保存备用；3、左肺10%甲醛固定48h，后续病理检测。

1.3.3标本病理染色检测取48h固定后的左肺，脱水、浸蜡、包埋、切片，行苏木精-伊红染色，应用病理图像分析系统，使用光学显微镜对肺组织的病理变化进行观察。

1.3.4取肺泡灌洗液按TNF-a的Elisa试剂盒说明书操作，测得OD值，通过标准曲线算出浓度。

1.3.5各组大鼠肺组织中TNF-α和p38MAPKmRNA的检测采用qRT-PCR法使用RNA提取试剂盒对肺组织总RNA进行提取，用逆转录试剂盒逆转录RNA成cDNA。内参选用β-actin，选择20μL体系进行qRT-PCR扩增。用2-△△CT表示受检组织中TNF-α和p38MAPKmRNA的相对表达量。

1.4统计学方法

采用SPSS20.0统计软件。计量资料用x-±s表示，正态性检验后采用单因素方差分析，组间比较用LSD-t检验，同一组内不同时间点比较用完全随机t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

实验开始后，NS组大鼠进食正常，毛发顺白，精神状态尚好，行动自如。PQ组大鼠进食、饮水量较NS组减少，毛发粗糙、稀疏，精神疲、行动缓慢，易激惹，口唇及鼻部偶见血性分泌物。PQ＋SB组大鼠可见与PQ组类似的中毒症状，但症状较PQ组轻。

2.1肺组织病理学改变NS组的大鼠肺大体观呈均匀粉红色，包膜光滑、柔软、弹性好；光镜下观察组织结构清晰，肺泡腔无炎性细胞浸润，肺泡壁薄，间质血管无扩张，支气管黏膜上皮完整。PQ组的大鼠未灌洗之前肺大体观可见组织肿胀，色不均匀，表面可见大面积出血点；光镜下组织内可见较多肺泡萎陷，肺泡壁毛细血管扩张、淤血，伴灶性肺泡内出血，部分肺泡腔内有水肿液，肺内可见大量炎症细胞浸润，肺间质水肿，肺泡间隔不同程度增宽。PQ＋SB组的大鼠肺组织病变轻于染毒组，肺泡内出血及炎症细胞浸润减少，肺间质水肿程度减轻。见图。

NS组PQ组PQ+SB组

3.讨论

百草枯病人存活率低，尚未有良好的治疗方法。病人食入后由于无法及时洗胃常常已经吸收，而百草枯早期可与胺类物质竞争肺泡Ⅱ型细胞的能量依赖性多胺摄取途径而选择性地在肺内聚集[4]。这种摄取系统主要存在于肺泡Ⅱ型细胞，同时也存在于气管Clara细胞和肺泡Ⅰ型细胞[5]。因此早期发现病人时百草枯往往已经在肺中积累较高浓度，而目前研究发现的百草枯中毒机制包括了氧自由基损伤、氧化应激损伤、胞内钙稳态失衡、炎症反应失衡、线粒体损伤、DNA损伤与细胞凋亡等[6]。众多研究发现炎症反应在百草枯中毒的病理发展进程中起重要作用，YangS等[7]提出PQ中毒早期有大量炎性细胞和免疫细胞浸润，其能分泌多种炎性介质，而炎性介质再反过来促进炎性细胞的浸润。

p38MAPK属于MAPK家族中的一员，是一条极其重要的环境压力应激反应通路。p38MAPK最初被认为是LPS刺激的巨噬细胞中检测到的一种酪氨酸磷酸化蛋白，对炎症细胞因子的产生具有重要作用，是亚砷酸盐、热休克或白介素-1刺激的细胞中MAPK活化蛋白激酶2（MK2）的上游激活激酶[8]。广泛的研究表明，p38MAPK在许多不同的组织中发挥着关键作用[9]。而Wang,X[10]等发现在百草枯中毒急性肾损伤中p38MAPK的磷酸化是增加的。TNF-α则主要由淋巴细胞、激活的巨噬细胞、内皮细胞、肥大细胞、成纤维细胞等分泌。参于了机体的炎症反应和免疫过程，是介导机体炎症反应的关键因子[11]。

本实验采用百草枯灌胃法，以100mg/kg的剂量来构建大鼠急性肺损伤模型，病理形态学上可见PQ组明显较同一时间点的NS组炎症明显，肺组织损伤加重，这与课题组前期构建的百草枯中毒急性肺损伤模型病理表现相同[12]。而应用了p38MAPK阻滞剂后，则改善了PQ所致的肺组织的损伤。SB203580是一种被应用广泛的高效p38MAPK阻滞剂，ChenX[13-14]等人用该阻滞剂制作了相关模型，发现成功降低了p38的磷酸化。通过本次实验结果，我们发现肺组织中的TNF-α和p38MAPKmRNA表达在PQ组的表达均高于同一时间点的NS组，而应用阻滞剂后在同样时间点则明显降低了TNF-α和p38MAPKmRNA的表达。但是同一组内,只有PQ组TNF-αmRNA随时间增加而增高，PQ+SB组无明显差异。这可能是由于p38阻滞剂作用于百草枯中毒的大鼠后，对TNF-αmRNA干预的降低速率在三天内较慢。检测肺泡灌洗液中的TNF-α蛋白表达水平发现，PQ组不同时间点表达均高于NS组，而应用阻滞剂后在第1天无明显差异，在第三天则能降低TNF-α蛋白表达水平。PQ+SB组也未能表现出TNF-α蛋白水平的时间依赖性减低。说明在p38MAPK阻滞剂干预后，百草枯中毒肺组织中的炎症介质TNF-α蛋白表达水平在第一天的影响不明显，而在第三天可以见到明显的降低。由p38MAPK的直接作用底物可知[15]，TNF-α本身不是p38MAPK的直接作用底物，而是经过中间相关分子后影响TNF-α的表达。YU[16]等做的模型中认为p38MAPK能影响核因子κB（nuclearfactorκB，NF-κB）的磷酸化，而NF-κB能影响TNF-α的转录。因此可解释其在一天内的影响并不明显。

综上，百草枯致急性肺损伤时，p38MAPK阻滞剂可以抑制肺组织中TNF-α蛋白和mRNA的表达，改善肺组织的炎症反应，从而减轻肺损伤，这提示了在百草枯中毒急性肺损伤过程中，p38MAPK可以通过影响TNF-α的表达，从而影响肺损伤时的肺组织炎症反应。

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基金项目：国家自然科学基金（编号：81360290）；广西自然科学基金（编号：2017GXNSFAA198249）；广西重点研发基金（编号：桂科AB17195002）