二甲双胍治疗PCOS中的作用和机制的研究

二甲双胍治疗PCOS中的作用和机制的研究

牛兰陈晶斌兰

1.首都医科大学石景山教学医院北京市石景山医院北京100043；

2.中国医学科学院北京协和医院北京100032；

3.首都医科大学石景山教学医院北京市石景山医院北京100043

【摘要】目的：观察二甲双胍对多囊卵巢综合征(PCOS)小鼠模型糖代谢、脂代谢、血清激素水平及小鼠卵巢组织肿瘤坏死因子TNF-α的水平的影响，探讨其对PCOS大鼠的治疗机制。方法：应用来脱氢表雄酮（DHEA）诱导的PCOS小鼠模型，选取20天大的雌性小鼠24只随机分为对照组、PCOS组、二甲双胍治疗组，每组8只。采用放射免疫法测定血清性激素睾酮（T）水平，光镜观察卵巢HE染色组织切片，血糖仪测定糖耐量．免疫化学法测定卵巢组织TNF—d的表达水平。结果：二甲双胍可明显降低小鼠血清的睾酮（T）的水平；使脱氢表雄酮（DHEA）诱变的卵巢组织的多囊化产生明显好转；降低小鼠血清中的TNF-α水平；明显改善因多囊卵巢综合征(PCOS)引起的小鼠模型的糖、脂代谢异常。结论：二甲双胍能够通过影响PCOS模型的糖代谢、脂代谢、血清激素水平、组织学形态及组织肿瘤坏死因子TNF-α的水平有效的治疗多囊卵巢综合征(PCOS)。

【关键词】多囊卵巢综合征；二甲双胍；肿瘤坏死因子TNF-α

【中图分类号】R711【文献标识码】B【文章编号】1674-8999（2015）6-0100-02

多囊卵巢综合症（PCOS）在适孕女性的不孕不育症中大约占据了6%—8%[1]。根据Rotterdam的诊断标准，符合以下三条的中两条的就能定义为PCOS：1、临床或生化检测为高雄激素血症;2、少发或无月经；3、通过超声检测发现为多囊卵巢[2]。由于伦理和可行性等原因，PCOS小鼠模型是我们研究PCOS相关问题的关键。MaheshandGreenblatt[3]首先从PCOS患者的卵巢中分离出了脱氢表雄酮（DHEA），从此，DHEA诱导的PCOS小鼠模型的应用日益广泛。在临床胰岛素增敏剂，例如双胍类药物，成为治疗PCOS的最常用的药物之一。然而，其机制我们目前并不是十分的了解。我们主要是DHEA诱导的PCOS模型来研究二甲双胍的作用机制。肿瘤坏死因子(TNF-α)在糖脂代谢中的作用日益受到关注，我们本实验的目的是为了探索二甲双胍是否是通过TNF-α来改善PCOS患者的糖脂代谢紊乱。

1材料和方法

1.1动物

C57BL/6J野生型小鼠（华阜康生物技术有限公司，动物合格证号SCXK(京)2009-0007），在20天大的24只小鼠按照体重和血糖水平进行随机分组。A组：正常对照组，皮下注射蓖麻油。B组：DHEA诱导的PCOS模型组，每天皮下注射DHEA(溶于蓖麻油，6mg/kg体重，相当于临床PCOS患者的血清雄激素水平)，连续注射90天。C组：DHEA+二甲双胍组，每天皮下注射DHEA（6mg/kg体重），同时每天灌胃二甲双胍（500mg/kg体重，相当于给一个临床治疗PCOS患者的用量），连续进行90天。

1.2主要试剂

二甲双胍，中美上海施贵宝生产，批号1303090，规格0.5g；

蓖麻油,内蒙古威宇生物科技有限公司；

脱氢表雄酮,深圳市新产业生物医学工程有限公司，纯度≥99.7%；

亚甲基蓝，江苏济川制药公司生产，批号110507,规格10ml:0.1g。

1.3试验方法

1.3.1卵巢的组织学分析

卵巢冰冻切片的HE染色用于组织学分析。冰冻切片的厚度为6um。主要过程为卵巢在4%的多聚甲醛固定4小时，30%蔗糖脱水8小时。OCT（冰冻切片的包埋剂，中杉金桥生物技术有限公司）包埋。

1.3.2阴道涂片

在三组小鼠处理30天后做连续一周的阴道涂片，并用0.1%亚甲基蓝溶液染色。

1.3.3口服葡萄糖耐量试验是（OGTT）

在三组小鼠给予90天处理后，做OGTT实验，小鼠禁食6小时，灌胃3g/kg葡萄糖。检测0min,15min，30min，60min，90min，120min时刻的血糖水平。

1.3.4激素，脂质和细胞因子的测定

下腔静脉取全血，离心，取上清。在北京北方生物技术研究所测定小鼠的雄激素，y胰岛素和TNF-α的水平。利用北京普利莱生物技术有限公司的胆固醇(CHO)，甘油三酯(TG)试剂盒测定小鼠的胆固醇和甘油三脂的水平。

1.3.5统计学分析

由于实验均是分三组进行，所有的统计结果都是利用方差分析进行统计的，三组之间的两两比较是用LSD的统计方法进行统计分析。实验数据均用SPSS15.0软件进行分析，各计量参数用x±s表示，三组均数之间的两两比较采用方差分析，对非正态分布资料统计分析前先进行对数转换。

2实验结果

2.1激素的水平

为了确定皮下注射DHEA对小鼠雄激素的提高水平和二甲双胍的作用。我们检测了三组小鼠血清的睾酮（T）的水平，结果如图1所示：B组的睾酮(T)明显高于A组。而B组和C组没有明显的差异。

图1：三组小鼠的血清睾酮的水平。方差分析结果显示A组和B组有显著性差异，而B组和C组没有明显区别。三组小鼠的胰岛素水平存在差异，B组明显高于A,C两组。而A组和C组没有明显差异。***：P<0.001，**：P<0.01。N=8,8,8

2.2卵巢组织形态学检测

卵巢的组织形态学特征是判断PCOS的最直接的证据之一。为了确定PCOS模型的是否成功和二甲双胍的作用，我们做了卵巢的HE染色，如图2。B组的卵巢明显的出现多囊的形态。A则表现出正常的形态，C组的卵巢和B组相比多囊化也明显的好转。

图2：三组小鼠卵巢组织学检测。图中分别是A、B、C、三组卵巢的HE染色。放大倍数都为40倍。冰冻切片的厚度都为6um。

2.3性周期的检测

PCOS患者多表现为月经周期异常，少发排卵或无排卵，性周期紊乱。我们利用连续阴道涂片检测三组小鼠的性周期。结果发现DHEA诱导的PCOS小鼠组（B组）的性周期出现明显的紊乱现象，多停留在动情期。而A组和C组基本都处于正常的性周期中。

2.4TNF-α的检测

为了确定DHEA处理的PCOS小鼠的TNF-α的改变，和二甲双胍对PCOS患者的作用是否通过TNF-α的介导。我们检测了血清中TNF-α的水平。如图3。

图3：我们分别检测了三组小鼠血清中的TNF-α的量。采用方差分析显示B组的量明显高于A、C两组。*：P<0.05；N=8，8，8。

2.5对糖代谢的影响

PCOS患者多数伴有糖耐量异常，糖耐量异常是PCOS患者使糖尿病和心血管疾病的发生大大提高。为了检测DHEA诱导的PCOS小鼠的糖耐量是否改变。我们在小鼠处理90天后进行了OGTT实验。实验发现小鼠的空腹血糖并未改变，而单纯DHEA处理的B组小鼠出现了明显的糖耐量异常；在二甲双胍与DHEA同时处理的C组中，小鼠的糖耐量较B组有明显的好转。如图4所示。

图4：DHEA诱导的糖耐量改变和二甲双胍的治疗作用。对每个点进行方差分析，发现在15min和30minB,C两组存在明显的差异。*：p<0.05

2.6对脂质的影响

作为体内脂质的反应指标，我们检测了血清胆固醇（CHO）和甘油三脂（TG）的水平。发现CHO和TG在B组都有明显的升高，而A,C两组没有显著的差异。

图5：左图是三组血清的胆固醇水平。右图是三组血清甘油三酯的水平，利用方差分析的方法进行统计。*：p<0.05，N=8，8，8。

3讨论

DHEA诱导PCOS小鼠模型已经成为PCOS研究中最常用的模型之一，我们的实验主要从激素水平，糖脂代谢，形态学等方面证实了DHEA的处理对于PCOS模型的诱导是成功的，例如出现了高雄激素血症，卵巢的多囊化，糖脂代谢紊乱性周期紊乱等表现。这为我们以后进一步研究PCOS提供了更多有利的条件。同时二甲双胍，这个临床上用于治疗PCOS的常用药物的作用是明显的。我们的实验证明二甲双胍明显的改善了PCOS小鼠的卵巢多囊化；同时对于血清的胰岛素也有一定得下调作用，改善糖耐量，说明二甲双胍提高了PCOS小鼠的胰岛素敏感性，这对于PCOS患者的长期预后和干预治疗提供了可靠的指导；对于脂代谢方面，二甲双胍也一定作用，显著降低了血清甘油三酯和胆固醇含量。

对于二甲双胍治疗PCOS机制的探讨：由于PCOS的发生是一个十分复杂的过程，包括代谢和内分泌等方面的紊乱，同时引起了多个系统的变化的多因素疾病。目前对于PCOS的发生原因主要集中在雄激素，基因的变化，氧化应激等方面。高TNF-α在PCOS患者中已有很多报到，我们的研究也证明了这点，以前的研究也表明DHEA和TNF-α有一定的线性关系，而DHEA又是PCOS发生的中心环节；TNF-α又对于调节糖脂代谢起着重要作用，而PCOS表现出糖脂代谢的异常，二甲双胍可以明显的改善这一系列的变化。于是我们提出了二甲双胍是否会通过对TNF-α的影响来治疗PCOS患者。从实验结果来看，二甲双胍的确下调的TNF-α，也明显的改善了PCOS小鼠的糖脂代谢，对于睾丸酮（T）也有一定下调趋势。所以我有理由认为二甲双胍是可能通过TNF-α的下调，进一步影响PCOS患者的糖脂代谢，类固醇激素的合成等途径来达到治疗的作用的。当然，还有很多方面需要我们去进一步探索，比如二甲双胍是否还可能通过其他的途径来治疗PCOS。二甲双胍是如何去影响TNF-α的水平，二甲双胍是如何改善PCOS患者的卵巢多囊化的等。

总之，我们的实验证明了二甲双胍在治疗PCOS的过程中TNF-α的确起了十分重要的作用。这为我们进一步去探索二甲双胍的全部作用机制提供了更多新的证据和线索。

参考文献

[1]FRANKSS.Polycysticovarysyndrome[J].NEnglJMed,1995,333:853–861.

[2]RotterdamESHRE/ASRM-SponsoredPCOSConsensusWorkshopGroup.Revised2003consensusondiagnosticcriteriaandlong-termhealthrisksrelatedtopolycysticovarysyndrome(PCOS)[J].HumReprod,2004,19:41–47.

[3]V.B.MAHESH,R.B.GREENBLATT.Isolationofdehydroepiandrosteroneand17-hydroxy-pregnenolonefrompolycysticovariesoftheStein–Leventhalsyndrome[J].Clin.Endocrinol.Metab,1962,(22):441–448.