HB-EGF对肺动脉平滑肌细胞作用的研究

HB-EGF对肺动脉平滑肌细胞作用的研究

梁洪华王康李海燕马秀涛黄子春覃家锦

（1广西医科大学广西南宁530021）

（2广西医科大学第一附属医院心胸外科广西南宁530021）

【摘要】目的：探讨HB-EGF的表达情况对肺动脉平滑肌细胞（PASMC）增殖、迁移的影响，以及HB-EGF对PASMC的作用与PI3K/AKT信号通路的关系。方法：将人肺动脉平滑肌细胞（HPASMC）分为：对照组、HB-EGF组、CRM197组、LY294002组。采用MTT法测定HPASMC的增殖情况；采用Transwell法测定HPASMC的迁移情况；采用WesternBlot法检测AKT的表达情况。结果：与对照组相比，HB-EGF组细胞的增殖、迁移明显增强（P<0.05），而AKT蛋白表达水平亦升高（P<0.05）；而CRM197组、LY294002组细胞的增殖、迁移均被抑制（P<0.05），AKT蛋白表达水平均降低（P<0.05）。结论：HB-EGF可刺激PASMC的增殖和迁移，其机制之一可能是通过激活PI3K/AKT信号通路。

【关键词】HB-EGF；PI3K；AKT；肺动脉平滑肌细胞；增殖；迁移

【中图分类号】R3【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2017）05-0025-03

EffectsofHB-EGFonPulmonaryArterySmoothMuscleCells

LiangHonghua1,WangKang1,LiHaiyan1,MaXiutao1,HuanZichun1,QinJiajin2

1.GuangxiMedicalUniversityNanning530021,China

2.DepartmentofCardiothoracicSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversityNanning530021,China

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectofHB-EGFontheproliferationandmigrationofpulmonaryarterysmoothmusclecells(PASMC)andtherelationshipbetweenHB-EGFandPASMCandPI3K/AKTsignalingpathway.MethodsHumanpulmonaryarterysmoothmusclecells(HPASMC)werepidedintocontrolgroup,HB-EGFgroup,CRMgroup197groupandLY294002group.TheproliferationofHPASMCwasdeterminedbyMTTassay.ThemigrationofHPASMCwasmeasuredbyTranswellmethod.TheexpressionofAKTwasdetectedbyWesternBlot.ResultsComparedwiththecontrolgroup,theproliferationandmigrationofHB-EGFgroupweresignificantlyincreased(P<0.05),whilethelevelofAKTphosphorylationinHB-EGFgroupwasalsoincreased(P<0.05);CRM197group,LY294002groupComparedwiththecontrolgroup,theproliferationandmigrationofthecellsintheCRM197groupandtheLY294002groupwereinhibited(P<0.05),andthephosphorylationlevelofAKTintheCRM197groupandtheLY294002groupwasdecreased(P<0.05).ConclusionsHB-EGFcanstimulatetheproliferationandmigrationofPASMC,oneofmechanismmaybethroughtheactivationofPI3K/AKTsignalingpathway.

【Keywords】HB-EGF;PI3K;AKT;Pulmonaryarterysmoothmusclecells;Proliferation;Migration

肝素结合表皮生长因子（heparin-bindingepidermalgrowthfactor，HB-EGF）是表皮生长因子（epidermalgrowthfactor，EGF）的其中一种配体，广泛存在于哺乳动物的多种组织中，能刺激细胞的增殖，在机体的多种生理过程及病理过程起着重要的作用，比如促进组织损伤和伤口愈合、生殖、血管生成，其过度表达与肿瘤和癌症的形成密切相关等[1，2]。研究表明，HB-EGF参与刺激肿瘤细胞的分化、增殖、侵袭，对平滑肌细胞的增殖、迁移亦起刺激作用[3]。本研究将探讨HB-EGF对HPASMC的影响。

1.材料与方法

1.1主要材料

酶标仪（Thermo公司），倒置显微镜（日本OLYMPUS），0.25%胰蛋白酶、胎牛血清、高糖DMEM培养液（南京维森特生物科技有限公司），MTT试剂（北京索莱宝生物科技有限公司），兔抗AKT多克隆抗体（美国Sigma公司），原代HPASMC（CM-H520，上海盖宁生物科技有限公司）。

1.2HPASMC的培养

购回原代HPASMC后，于5%CO2、37℃培养箱培养过夜。第二天，弃去瓶内培养液，PBS液冲洗2遍，然后用胰蛋白酶分离细胞，接着用血清培养基终止消化。转移至离心管，常温下1000转/分离心5分钟，弃上清液，用含10%胎牛血清高糖DMEM培养基重悬细胞，计数，用25cm2培养瓶，于5%CO2、37℃培养箱培养。隔天换液，细胞融合90%开始传代。取4～6代细胞备后续实验使用。

1.3实验分组及细胞增殖实验

取对数生长期HPASMC一瓶，洗涤2次，胰酶消化，离心，用含1%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞。于96孔板中每孔种200ul细胞悬液（5×103个），周围设不含细胞的空白对照孔，培养过夜。分为4组，对照组、HB-EGF组、CRM197组和LY294002组，各组分别加入：PBS液、含10ng/ml的HB-EGF、含20μg/ml的CRM197（HB-EGF抑制剂）、含25μmol/L的LY294002（PI3K阻滞剂），每组设5个复孔。在孵育48h后，每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml），避光孵育4h，弃培养基，每孔加入150ulDMSO溶液，震荡15min。用酶标仪选490nm波长检测各孔的光吸收值（OD值）。重复3次试验。算出细胞增殖率。细胞增殖率=实验组平均OD值/对照组平均OD值×100%。

1.4细胞迁移实验

取对数生长期HPASMC一瓶，冲洗2遍，胰蛋白酶消化，离心，用含0.1%胎牛血清DMEM培养基重悬细胞。每孔接种200ul（2×104个）细胞悬液于Transwell小室上室。每孔Transwell小室下室加600ul含10%胎牛血清DMEM培养基。各组上室分别加入：PBS液、含10ng/ml的HB-EGF、含20μg/ml的CRM197、含25μmol/L的LY294002。5%CO2、37℃孵育48h。取出小室，弃上室液体，甲醛中固定30min，结晶紫溶液中染色30min，用PBS液侵泡脱色2～3次，用棉签拭去上室内的细胞，晾干，置于干净载玻片上。用高倍显微摄像系统照相计数小室下层细胞。迁移细胞数为5个相邻视野细胞的平均值。

1.5AKT含量的测定

取对数生长期HPASMC，按上述对照组、HB-EGF组、CRM197组和LY294002组处理，48h后，离心收集细胞。在冰上裂解细胞，收集细胞碎片溶液，在4℃12000转/分离心5min，收集上清液即为细胞的蛋白溶液。SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE），转PVDF膜，封闭，分别加入1:500兔抗AKT多克隆抗体4℃孵育过夜，二抗常温下孵育1h，TBST脱色3次，暗室曝光，置于显影剂显影，置于定影剂定影，冲洗胶片。运用凝胶图片处理系统分析蛋白条带。

1.6统计学方法

采用SPSS16.0统计软件进行数据分析，各组数据以均数（-x）±标准差（s）表示，多组间均数的比较用方差分析处理数据。以P<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1HB-EGF对HPASMC增殖的影响

MTT实验结果显示，与对照组相比，HB-EGF组HPASMC的增殖被明显刺激增强（P<0.05），CRM197组和LY294002组HPASMC的增殖被明显的抑制（P<0.05）。见图1。

2.2HB-EGF对HPASMC迁移的影响

Transwell小室结果显示，与对照组相比，HB-EGF组HPASMC的迁移被明显刺激增强（P<0.05），CRM197组和LY294002组HPASMC的迁移受到明显的抑制（P<0.05）。见表。

3.讨论

HB-EGF的过度表达在肿瘤形成的过程中扮演着重要的角色，调节肿瘤细胞的存活、增殖和迁移，并且在目前癌症的单克隆抗体靶向治疗中，HB-EGF是一个重要的研究靶点[4]。HB-EGF在平滑肌中同样存在着很明显的作用。研究表明，HB-EGF可促进血管的重塑、新生血管的形成，并可促进气道平滑肌细胞的增殖和迁移[5，6]。在HPASMC中HB-EGF是否亦存在同样的作用呢。本研究对HB-EGF对HPASMC的作用进行了探讨。

本研究结果发现，与对照组相比，HB-EGF组外源性增加HB-EGF后HPASMC的增殖和迁移均增强（P<0.05），而CRM197组在选择性抑制HB-EGF后以及LY294002组阻滞了PI3K后HPASMC的增殖和迁移均被抑制（P<0.05）。

平滑肌细胞增殖、迁移的调控非常机制复杂，可以同时通过多条信号通路进行调控。PI3K/AKT是很重要的一条信号通路，其通过上游因子激活PI3K/AKT信号通路，介导p38蛋白等下游因子的表达，调控周期蛋白的表达，调控平滑肌细胞的增殖和迁移[7]。HB-EGF可以通过PI3K/AKT通路刺激平滑肌细胞的增殖和迁移[8]。本研究探讨了HB-EGF是否可通过PI3K/AKT信号通路刺激HPASMC的增殖及迁移。

本研究结果显示，与对照组相比，HB-EGF组外源性增加了HB-EGF后HPASMC表达AKT蛋白水平明显增强（P<0.05），而CRM197组在选择性抑制了HB-EGF后和LY294002组阻滞了PI3K后HPASMC表达AKT蛋白水平明显减弱（P<0.05）。

综上所述，HB-EGF可刺激PASMC的增殖和迁移，其机制之一可能是通过激活PI3K/AKT信号通路。但详细的调节机制复杂，有待进一步的研究。

【参考文献】

[1]TaylorSR,MarkesberyMG,HardingPA.Heparin-bindingepidermalgrowthfactor-likegrowthfactor(HB-EGF)andproteolyticprocessingbyadisintegrinandmetalloproteinases(ADAM)：aregulatorofseveralpathways[J].SeminCellDevBiol.2014Apr；28:22-30.

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[8]WangQ,LiH,YaoY,LuG,WangY,XiaD,etal.HB-EGF-PromotedAirwaySmoothMuscleCellsandTheirProgenitorMigrationContributetoAirwaySmoothMuscleRemodelinginAsthmaticMouse[J].JImmunol.2016Mar1；196(5)：2361-7.

基金项目：

广西自然科学基金（项目编号：2013GXNSFAA019151）