对药“知母黄柏”的正交提取工艺研究

对药“知母黄柏”的正交提取工艺研究

赵维扬1邓洁雄2吴晓薇1周海玲1

赵维扬1邓洁雄2吴晓薇1周海玲1

（1广东省中医院药学部广东广州510120）

（2广州市药品检验所四分所广东广州510405）

【摘要】目的：研究对药知母、黄柏的最佳提取工艺。方法：以知母、黄柏为原料，盐酸小檗碱的含量及出膏率加权为评价指标，采用单因素实验与L9(34)正交实验相结合的方法化选出对药知母、黄柏的最佳提取工艺。结果：80%的乙醇水溶液是对药知母、黄柏的最佳提取溶媒，最佳的提取工艺是10倍量80%的乙醇水溶液热回流提取3次每次3小时。结论：10倍量80%的乙醇水溶液热回流提取3次每次3小时所得样品中盐酸小檗碱含量出膏率最佳。

【关键词】黄柏；知母；盐酸小檗碱；提取工艺；正交试验

【中图分类号】R243【文献标识码】B【文章编号】2095-1752（2015）24-0291-03

“药有个性之特长,方有合群之妙用”,中药通过配伍组成方剂,或可以提高与改变疗效,或可以减低毒性与副作用,以适应复杂多变的病情,是临床治疗疾病的主要形式。中药的配伍应用是祖国医学的优势所在,配伍理论也体现了中医药理论的重要特色。配伍理论涉及较广,“君臣佐使”、“七情合和”,随着时代的进步,对配伍理论的研究和方剂配伍规律的深入探讨,日渐引起学术界的高度重视。

中药配伍应用是中医药学的优势之一,配伍理论也是中医基础理论之一、是中医药应用的重要特色。中药配伍后可以使有效成分在数或量上得到增加，从而取得更佳的临床疗效[1,2]。药对，又称对药，特指临床用药中常用的、相对固定的两味药物的配伍形式，是中药配伍方法的精髓[3]。知母和黄柏是临床常用的清虚热药对之一。本文就该药对的提取工艺进行优化研究。

1.仪器与材料

1.1仪器

LC-20AT型高效液相色谱仪，日本岛津公司产品；KQ-300B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；HH-2型数显恒温水浴器，河南石予华仪器有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；Y4W1103型远红外恒温干燥箱，天津市华北实验仪器有限公司；KDM型调温电热套，山东省邺城永兴仪器厂。

1.2材料

知母，黄柏购自安国药材市场；盐酸小檗碱，中国药品生物制品鉴定所（批号：110713-200911）；甲醇、乙腈均为色谱纯，天津市康科德科技有限公司，氢氧化钠、冰乙酸、95%的乙醇水溶液、磷酸为分析纯，天津市北方天医化学试剂厂。

2.方法与结果

2.1标准品溶液的制备

取盐酸小檗碱对照品适量,精密称定，加入流动相（乙腈：0.1%磷酸水50:50），制备成0.10mg∕ml的对照品溶液，用0.45μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2供试品的制备

取本品黄柏粉末（过三号筛）约0.1g，精密称定，置100ml量瓶中，用80ml流动相（乙腈：0.1%磷酸水=50:50）超声处理（功率250W，频率40kHz)40min，放冷，用流动相稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3色谱条件与检测方法

色谱柱：SinoChromODS-BP（4.6*250mm，5μm）；柱温：室温；流速：1.000ml/min；进样量：10μl，检测波长:260nm,流动相：采用梯度洗脱，见表1。

表1流动相梯度

时间（min）乙腈0.1%磷酸水（NaOHpH3.0）

01090

103070

153565

2.4方法学考察

2.4.1专属性试验分别将盐酸小檗碱对照品溶液、样品溶液和黄柏阴性溶液按2.3色谱条件进样，记录色谱图，结果见图1-3，由色谱图可知黄柏阴性无干扰，该分析方法适合盐酸小檗碱的含量测定。

2.4.2精密度试验取同一对照品溶液，按照2.3色谱条件进样，于24h内连续测定6次，测定盐酸小檗碱峰面积，计算RSD=0.23%，结果表明盐酸小檗碱精密度良好。

2.4.3标准曲线的制备取盐酸小檗碱对照品溶液，分别以1、2、4、6、8、10μl为进样量，用2.3色谱条件测定的峰面积峰值，进行回归处理计算的标准曲线方程是y=5472736.04x-75029.52（r=0.9999）。结果表明峰面积与盐酸小檗碱质量呈线性关系。

2.4.4重复性试验取知母、黄柏药材，平行6份，按2.3色谱条件进样，测定盐酸小檗碱峰面积，计算RSD=1.77%，结果表明此法重复性良好。

2.4.5稳定性试验取同一对照品溶液，按照2.3色谱条件进样，分别在0，2，4，6，8，10，24和48h进行检测，测定盐酸小檗碱含量，计算RSD=3.87%，结果表明盐酸小檗碱在48h内稳定。

2.4.6回收率试验在6份已知质量浓度的样品溶液中加入等质量的盐酸小檗碱对照品溶液，按2.3色谱条件进样，测定盐酸小檗碱峰面积，计算质量浓度和回收率，结果盐酸小檗碱的加样回收率为103.82%，RSD为1.41%。

2.5出膏率的测定

按处方精密称定黄柏5.0g等药材，加入250ml圆底烧瓶中，再加入100ml80%的乙醇水溶液，加热回流提取提取2次，每次2h，过滤，合并滤液浓缩至一定体积，取10ml于已经至恒重的蒸发皿，水浴挥干，置恒温干燥箱105℃干燥至恒重，称得重量，计算出膏率，出膏率（%）=（M’×V）/（V’×M）

M’-干燥后干膏重量

V-浓缩后的体积

V’-精密吸取药液体积

M-药材重量

2.6正交试验优化热回流提取工艺研究

2.6.1正交试验设计方案

选择乙醇浓度（A）、提取时间（B）、液料比（C）、提取次数（D）作为参考因素；以盐酸小檗碱的出膏率及含量作为评价指标；按L9(34)正交设计表试验。所选因素水平见表2。

表2因素水平表

综合评分法是依据各个指标重要程度，确定相应指标的组合系数或权后，对试验进行综合评分。对出膏率和含量的方差分析结果进行加权，其中出膏率占20%，含量占80%，详见表3，通过统计学方法分析对出膏率影响大小依次为提取次数>乙醇浓度>提取时间>液料比，其中提取次数（D）对盐酸小檗碱提取有显著的影响，乙醇浓度（A）提取时间（B）液料比（C）为次要因素，根据直观分析表及方差分析表，得到最终的较优方案为D3A2B3C3，80%的乙醇水溶液提取3次，每次3h，液料比为1:10。

2.6.3最优提取工艺验证实验

分别称取10倍处方量的各药材，按3.4.2所得最佳工艺条件，平行进行3组验证实验，分别取1ml提取液稀释10倍用0.45μm微孔滤膜滤过；按3.2.2下色谱条件进样，以峰面积计算；得盐酸小檗碱的含量。结果表明，验证试验结果与正交试验结果一致，在优化条件下盐酸小檗碱为平均出膏率39.81%，含量为45.12mg/g；该提取工艺基本稳定。最佳工艺为10倍量80%的乙醇水溶液提取3次每次3小时。

表4最优提取工艺验证实验的结果

样品123均值

盐酸小檗碱出膏率（%）39.8739.3740.1839.81

盐酸小檗碱含量（mg/g）44.4245.1045.8445.12

4.讨论

本实验选取乙醇浓度、提取时间、液料比、提取次数作为主要因素，以盐酸小檗碱含量及出膏率加权为指标，设计L9（34）正交试验，优化得出盐酸小檗碱提取的最佳工艺，为该药对的提取提供实验数据。

【参考文献】

[1]段金廒,宿树兰,唐于平，等.中药药对配伍组合的现代认识[J].南京中医药大学学报,2009,25(5):330-333.

[2]王曼华,孙化萍,梁建卫.经方“药对”配伍理论研究概况[J].辽宁中医药大学学报,2008,10（1）：59.

[3]王鸣，杨文华.中药对药君、臣、佐、使配伍规律研究[J].中医杂志，2013,54(22):1974-1975.

赵维扬（1983.12至今），男，籍贯广东潮阳，中药师，研究方向：中药学