基层医院分离及鉴定嗜血杆菌的方法探讨

基层医院分离及鉴定嗜血杆菌的方法探讨

吴斌斌

（天水四〇七医院检验科；甘肃天水741000）

摘要：嗜血杆菌（Haemophilus）是苛养性细菌，主要寄生在呼吸道内，是引起儿童严重细菌感染和社区获得性肺炎的重要病原菌之一[1]。引起人类致病的主要有流感嗜血杆菌（haemophilusinfluenzae,HI）和副流感嗜血杆菌（hemophilusparainfluenzae,HPI）。嗜血杆菌培养条件要求严格，除一般37℃，5％CO?的条件外，还需要添加成分X/V因子，而且其菌落针尖大小，同时和其他细菌混合生长而不容易被发现。在基层实验室，受条件限制，嗜血杆菌的检出率极低，因而导致由此细菌引起的呼吸道感染未得到及时控制，贻误病情。这就需要工作人员有丰富的经验，探索简便、经济、实用的方法来分离和鉴定嗜血杆菌。我院儿科呼吸道感染患者中嗜血杆菌分离率较高，本文就此分享工作中总结的经验，供大家探讨。

材料

1.1标本来源

我院儿科呼吸道感染患者的标本痰液、一次性雾化抽吸痰。

1.2培养基

培养基均购自赛默飞世尔生物化学制品(北京）公司，有哥伦比亚型血平板增菌培养基，MH琼脂平板，耐万古霉素巧克力琼脂平板。规格10×90mm。

1.3试剂与仪器

3%过氧化氢溶液，氧化酶纸片，标准菌株金黄色葡萄球菌ATCC29523，流感嗜血杆菌ATCC49247均购自康泰生物责任有限公司。奈瑟/嗜血杆菌生化-药敏试验卡购自湖南长沙天地人科技有限公司。细菌鉴定仪器为天地人TDR-200C购自湖南长沙天地人生物科技有限公司。

方法

2.1标本的接种

用无菌拭子挑取合格痰液标本（合格标本的判断标准[2]为直接涂片染色镜检：白细胞>25/低倍视野，上皮细胞<10/低倍视野），立即接种于耐万古霉素巧克力琼脂平板、哥伦比亚性血平板增菌培养基、3号麦康凯琼脂平板、科马嘉平板,置37℃、5%CO?孵育箱中过夜（18-24小时）培养。所有操作严格按照标准检验程序[3]进行。同时痰液涂片，染色，备用。

2.2细菌的分离与鉴定

18-24小时后哥伦比亚型血平板增菌培养基上菌落针尖大小，多在草绿色链球菌或葡萄球菌周围密集生长。耐万古霉素巧克力琼脂平板上生长的圆形、中等大小、湿润、扁平、边缘整齐、半透明似露水滴样的菌落。易和淋病奈瑟菌混淆。同时结合原始痰液标本涂片，如果找到大量脓细胞，脓细胞吞噬或伴行（鱼群样）革兰氏阴性小杆菌。即初步推断致病菌可能是嗜血杆菌。从耐万古霉素巧克力琼脂平板上挑取疑似菌落分纯于耐万古霉素巧克力琼脂平板。置37℃、5%CO?孵育箱中过夜（18-24小时）培养。挑取单个菌落进一步做实验，大部分菌株触酶阳性（+），氧化酶阴性（-），涂片镜检示革兰氏阴性小杆菌。同时做“卫星现象”实验。“卫星试验”实验在哥伦比亚型血平板增菌培养基和MH平板上用待测菌密涂一区，用流感嗜血杆菌ATCC49247密涂上述两个平板剩余一半的一区，作为质控。用标准菌株金黄色葡萄球菌ATCC29523在哥伦比亚型血平板增菌培养基和MH琼脂平板的待测菌一侧及质控菌一侧分别竖着画两道短线（划线与密涂线交叉或垂直）。分纯到耐万古霉素巧克力琼脂平板上的菌落用湖南长沙天地人生物科技有限公司细菌鉴定仪器TDR-200C将细菌鉴定到种。

3.结果

3.1判读

“卫星现象”（satellitephenomenon）实验是当将金黄色葡萄球菌与流感嗜血杆菌在同一血琼脂平板上共同培养时，由于前者能合成较多的Ⅴ因子，促进后者生长，故在金黄色葡萄球菌菌落周围生长的流感嗜血杆菌菌落较大，距离越远的菌落越小[4]。流感嗜血杆菌需要Ⅹ/Ⅴ因子和副流感嗜血杆菌仅需要Ⅴ因子可以简单区分菌种。若血平板增菌培养基（哥伦比亚型）和MH琼脂平板上出现“卫星现象”，可以初步断定为副流感嗜血杆菌。若血平板增菌培养基（哥伦比亚型）上出现“卫星现象”和MH琼脂平板上未出现“卫星现象”，可以初步推断为流感嗜血杆菌。结合仪器结果与实验相符后发报告。

3.2我院儿科2015年6月1日至2017年6月1日嗜血杆菌检出率统计表

4.讨论

流感嗜血杆菌（Hemophilusinfluenzae，Hi）是目前国内儿童急性下呼吸道感染中最主要的病原体，儿童急性下呼吸道感染有29.0%由Hi感染所致[6]。嗜血杆菌在初代培养时，菌落细小。这些都是考验基层实验室人员技术水平，硬件检测仪器性能，临床医生正确留取标本方法的时机等等，上述任一环节出现问题，都将影响其分离率。针对这一临床常见但不易分离的嗜血杆菌，加上儿科患儿自身留取痰液困难，不合格率高等，我科微生物室人员和临床医生密切沟通，最后达到一致认识。发热患儿一入科室立即送检细菌培养。下呼吸道感染患者临床通常采取自然咳痰法留取标本，常带有上呼吸道的正常菌群，使临床痰标本培养阳性率不高，甚至出现培养结果与临床不符等现象[7]。因此，临床医生多执行雾化抽吸痰液送检。为了避免漏检，应在初次接种痰液时用无菌拭子多次涂抹培养基一区。我科推荐使用赛默飞世尔生物化学制品（北京）公司的耐万古霉素巧克力琼脂平板，其上生长类似嗜血杆菌菌落，用仪器鉴定和“卫星现象”验证等方法，可以快速、简便、准确的鉴定菌种，为临床医生对发热患儿抗生素选用做到有的放矢。

参考文献

[1]李云.儿童呼吸道嗜血杆菌的感染情况分析[J].现代预防医学，2009,36（7）：1389-1392.

[2]鹿红梅，撒珂，张富.痰标本涂片镜检的临床价值分析[J].总装备部医学学报，2009,11（4）：232-233.

[3]张卓然主编.临床微生物学和微生物检验.人民卫生出版社，2003,177-180

[4]李仲兴，郑家齐，李家宏.诊断细菌学[M].香港：黄河文化出版社，1992:440.

[5]赖国祥，叶礼燕，李玉德，等.儿童下呼吸道流感嗜血杆菌感染的临床调查.中华儿科杂志，1997,35（11）：590-592

[6]张泓，陆权，李万华，等.小儿急性呼吸道感染流感嗜血杆菌耐药性研究.临床儿科杂志，2003,21（1）：17-19.

[7]中国疾病预防控制中心.痰涂片镜检质量保证手册[M].3版.北京：中国协和医科大学出版社，2004:320.