抗骨刺酊微生物限度检查方法验证

抗骨刺酊微生物限度检查方法验证

龙欢周胡雪来

湖南中医药高等专科学校附属第一医院湖南省直中医医院湖南株洲412000

ValidationmethodforthemicrobiallimitstestofKangguciDing

LONGHuanzhouHUXuelai（TheFirstAffiliatedHospitalofHunanTraditionalChineseMedicalCollege（HunanProvincialHospitalOfTraditionalChineseMedicine），Zhuzhou，Hunan412000）

【摘要】目的：建立抗骨刺酊的微生物限度检查方法。方法：按照《中国药典》2010版一部附录微生物限度检查法验证的要求对抗骨刺酊微生物限度检查进行了方法建立和验证研究。供试液制备采用稀释法，制成1∶10供试液。采用培养基稀释法（1∶10供试液，每皿1mL）进行细菌计数检验，稀释法（1∶10供试液，每皿1mL）进行霉菌及酵母菌计数检验，采用常规法进行控制菌检查。结果：5种验证菌株的回收率均高于70%；控制菌检查经方法验证，可按常规法进行金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌检查。结论：建立的方法准确、可靠、重现性好，适用于抗骨刺酊的微生物限度检查。

【关键词】抗骨刺酊；微生物限度；方法验证

抗骨刺酊是由制川乌、制草乌、独活、五加皮、赤芍等25味中药组成的医院自制制剂。功能祛风除湿，活血通络止痛。主治退行性骨关节炎，骨质增生性疼痛，风湿性关节疼痛。按《中国药典2010年版一部》[1]要求，需做细菌数、霉菌及酵母菌数、控制菌检查，同时需对检验方法进行验证，以确保检验方法的准确可靠。

1试验材料

1.1仪器净化工作台、手提式压力蒸汽消毒器、恒温水浴锅、TP-320A电子天平（感量0.01g）、恒温培养箱、生化培养箱、锥形瓶（100～150mL）、平皿（90mm）、量筒（100mL）、试管（18×180mm）及塞、吸管（1mL分度0．01mL，10mL）均于180℃干热灭菌2h或高压蒸汽121℃灭菌30min，烘干备用。

1.2试验样品抗骨刺酊湖南中医药高等专科学校附属第一医院（批号：140315、140611、131121）

1.3实验菌株金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、大肠埃希菌CMCC（B）44102、枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501、白色念珠菌CMCC（B）98001，黑曲霉CMCC（F）98003等，均购自中国医学细菌保藏中心。

1.4培养基营养琼脂培养基（批号：140625）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号：141203）、改良马丁培养基（批号：140527）、改良马丁琼脂培养基（批号：140708）、营养肉汤培养基（批号：140614）、胆盐乳糖培养基（批号：141115）、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（201405137）、卵黄氯化钠琼脂培养基（201405051）（均由北京路桥技术有限公司生产）

1.5试剂及稀释剂pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液（批号：140216，由北京路桥技术有限公司生产）、氧化酶试液（批号：140206）、冻干兔血浆（批号：140905）（由北京陆桥技术有限责任公司提供）、0.9％灭菌氯化钠溶液。

2细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证[2][3]

验证试验进行三次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。

2.1方法

2.1.1菌液制备接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养肉汤中，在30～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，在25℃培养24～48小时。上述培养物均用0.9％灭菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数为50～1OOCFU的菌悬液，备用。

2.1.2供试液制备分别取供试品各10mL，加pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液制成1：10的均匀供试液，备用。

2.1.3试验组细菌计数采用常规法。取1：10的供试液1mL，置平皿中，每个平皿加试验菌液1mL．加入营养琼脂培养基15～20mL，平行制备2个平皿，放冷，倒置平板，在30～35℃温度培养48小时，观察结果。按《中国药典2010年版一部》微生物限度菌落计数方法测定菌数。

霉菌和酵母菌计数采用常规法，取1：10的供试液1mL．置平皿中，每个平皿加试验菌液1mL，加入玫瑰红钠琼脂培养基15～20mL，平行制备2个平皿，放冷，倒置平板，在25℃温度培养72小时，观察结果。按《中国药典2010年版一部》微生物限度菌落计数方法测定菌数。

2.1.4菌液组分别取50～100CFU／mL的试验菌液1mL注入平皿中，立即倾注培养基，平行制备2个平皿，置适宜温度培养48～72小时，观察结果，按《中国约典2010年版一部》微生物限度菌落计数方法测定菌数。

2.1.5供试品对照组按《中国药典2010年版一部》微生物限度菌落计数方法测定本品的本底数。采用常规法检查细菌数、霉菌及酵母菌数。

2.1.6稀释剂对照组取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1mL代替供试液，余下同试验组。

2.2菌回收率试验验证试验进行三次独立的平行试验，并分别计算各次试验的菌回收率。

试验组平均数—供试品对照组平均数

2.3结果判断试验组及对照组的菌回收率均应不低于70％。

2.4实验结果经试验验证，各试验菌株及稀释剂对照组菌回收率均大于70％，符合《中国药典2010年版一部》常规法要求，结果见表1。

3控制菌检查方法的验证[2][3]

本品为局部给药制剂，因此以铜绿假单胞菌作为验证菌株，检查铜绿假单胞菌；以金黄色葡萄球菌作为验证菌株，检查金黄色葡萄球菌；以大肠埃希菌为阴性对照菌株。

菌液：取细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证中的50～100CUF/mL的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌菌悬液。

3.1铜绿假单胞菌

3.1.1试验组取1：10的供试液10mL以及50～100CFU/mL的铜绿假单胞菌菌液1mL接种至1OOmL胆盐乳糖培养基中，在35℃培养18～24小时。

3.1.2阳性对照组取50～100CFU/mL的铜绿假单胞菌菌液1mL接种至1OOmL胆盐乳糖培养基中，在35℃培养18～24小时。

3.1.3阴性菌对照组取1：10的供试液10mL以及50～100CUF/mL的大肠埃希菌菌液1mL接种至10OmL的胆盐乳糖培养基中，在35℃培养18～24小时。

3.1.4结果判断取上述培养物，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，培养18-24小时。如平板上无菌落生长或生长的菌落与铜绿假单胞典型菌落形态特征不符，判供试品未检出铜绿假单胞菌。如平板生长的菌落与铜绿假单胞典型菌落形态特征相符或疑假，应挑选2－3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18-24小时。取斜面培养物进行革兰染色、镜检及氧化酶试验。

3.1.5实验结果铜绿假单胞菌检查法采用常规法检查，阳性对照菌能正常生长，阴性对照菌未检出。结果见表2

3.2金黄色葡萄球菌

3.2.1试验组取1：10的供试液10mL以及50～100CFU/mL的金黄色葡萄球菌菌液1mL接种至100mL的营养肉汤培养基中，在35℃培养18～24小时。必要时可延长至48小时。

3.2.2阳性对照组取50～100CFU/mL的金黄色葡萄菌菌液1mL接种至10OmL营养肉汤培养基中，在35℃培养18～24小时。

3.2.3阴性对照组取1：10的供试液10mL以及50～100CFU/mL的大肠埃希菌液1mL接种至10OmL营养肉汤培养基中，在35℃培养18～24小时。

3.2.4结果判断取上述培养物，划线接种于卵黄氯化钠培养基的平板上，培养24-72小时。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于金黄色葡萄球菌菌落形态特征，判未检出金黄色葡萄球菌。若平板上生长的菌落与金黄色葡萄球菌菌落形态特征相符或疑似，应挑选2-3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18-24小时。取营养琼脂培养基的培养物进行革兰染色，并接种于营养肉汤培养基中，培养18-24小时。作血浆凝固酶实验对疑似菌进行确认。若疑似菌为非革兰阳性球菌、血浆凝固酶实验阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。

3.2.5实验结果金黄色葡萄球菌检查法采用常规法检查，阳性对照菌能正常生长，阴性对照菌未险出。结果见表3。

4.验证试验小结

上述试验表明：本品采用常规法对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌、白色念珠菌生长均无影响。其试验组、稀释剂对照组回收率均达70％以上，同时按常规法对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌进行了验证试验，符合《中国药典2010年版一部》微生物限度检查验证试验要求。以此确定本品微生物限度检查法如下：取本品10mL，加pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液至100mL制成1：10供试液。采取常规法检查细菌数、霉菌和酵母菌数，采用常规法检查金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌。

参考文献：

[1]中国药典[S].2010版.一部.附录ⅩⅢC：79.

[2]王玉，毛德法，秦昆明，蔡宝昌.参蓉健腰酒微生物限度检查方法学的验证[J].中国实验方剂学杂志.2010（18）

[3]杨静.药品微生物限度检查法的影响因素分析[J].中国药事.2008（12）

作者简介：

龙欢周，湖南中医药高等专科学校附属第一医院，湖南株洲。