两种组织工程支架性能的实验研究

两种组织工程支架性能的实验研究

张蕊柏国艳赵彬(通讯作者)张芳

张蕊1柏国艳1赵彬2(通讯作者)张芳3

(1山西医科大学030001;2山西医科大学口腔医院修复科030001;3山西医科大学口腔医学系030001)

【中图分类号】R68【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2013)11-0427-02

【摘要】目的对两种组织工程支架的性能进行研究，为寻求更符合组织工程的支架提供实验依据。方法采用二次冻干技术制备CS-SF-TCP及CS支架，采用液体替代法等方法对两种支架的一般性能进行测定，将制备成一定体积的两种支架植入Wistar大鼠的背部，于2、4、6、周取出植入物行组织学染色观察。结果制备的两种支架成白色海绵状物质，孔隙率为70%-80%，孔径值为100-150µm。埋植支架周围皮下组织无充血、化脓等现象,无组织坏死发生,植入部位早期有轻度的炎症反应,后较快消退。植入物表变均被致密的薄层纤维膜包绕。组织染色结果可见支架的表面有细胞附着，两种支架内部孔隙失去连接，有断裂吸收现象。结论单纯CS支架在体内降解过快，CS-SF-TCP支架具有良好的降解性与组织相容性,是一种很有潜力的组织工程支架材料。

【关键词】组织工程丝素壳聚糖支架

TheexperimentalstudyofpropertyabouttwokindsoftissueengineeringscaffoldsZHANGRuiZHAOBinBAIGuo-yanZHANGFangDepartmentStomatologyofShanxiMedicaluniversityTaiyuan030001china

【Abstract】PURPOSE:Thepurposeofthestudyistoresearchthepropertyaboutthechitosanscaffoldandthechitosan-silkfibroin-tricalciumscaffold,inordertofindthemoresuitablescaffoldfortissueengineering.METHODS:Thetwoscaffoldswerepreparedbyfreezingandlyophilizingtakingwaterasthehole-makingagent.Thetwoscaffoldsphosphatecomplexwasimplantedinthedorsalmusclesofratsforassessmentofinvitroandinvivodegradationaswellasbiocompatibility.RESULTS:Thesescaffoldsphosphatecomplexwasspongy,withuniformporosityandirregular

shapesofpores.Theporeswereconnectedwitheachother,withaporosityof70%-80%anddiameterofapproximately100-150μm.Alltheimplantswerecoveredbythickmemberance.Thesescaffoldswerelosstheconnect.ConclusionThechitosan-silkfibroin-tricalciumphosphateporouscomplexwasmoreappropriateasthetissueengineeringscaffold.

【Keywords】TissueengineeringSilkfibroinChitosanScaffold

前言

骨组织工程的兴起为临床上各类骨缺损的修复提供了良好的思路。三维多孔支架是骨组织工程的重要基础，它不仅起到支撑，保持原有组织形状的作用，而且还为种子细胞提供生长，分化的空间。从而引导缺损组织的再生，起到“桥梁”的作用。

磷酸三钙类似于人骨的天然无机构成,植入后与机体骨接合良好，骨传导性好且具有良好的生物相容性及生物降解性,是目前应用于骨组织工程最普遍的材料。但其生物强度差，受冲击能力弱，不能用于负荷部位的骨缺损。另外它的降解速率与新骨形成的速率不一致，并不能完全符合生物支架的要求[1]。壳聚糖为天然的高分子多聚糖，是甲壳素脱乙酰化后的产物，具有良好的生物组织相容性，乙酰度的改变可改变壳聚糖的降解性，目前已广泛应用于生物医学工程领域，单纯壳聚糖制备的支架脆性大、韧性差、降解慢且孔径小[2～5]。丝素蛋白是蚕丝的主要成份，约占蚕丝质量的70%～80%。在2000年国外学者Hajime就已经发现丝素蛋白比其他的天然高分子有突出的优越性[6]。用其做成的手术缝线已在临床上有几十年的应用历史。研究表明丝素蛋白无毒无污染、良好的组织相容性、无刺激、较其他的天然高分子材料降解慢的优点。丝素蛋白可制成临床上所需的各种形状来满足需要。丝素蛋白在骨组织工程方面的研究已光泛的引起关注。本实验旨在探讨CS-SF-TCP较CS支架的优越性，为组织工程提供实验依据。

1材料与方法

1.1主要试剂和仪器

丝素蛋白粉(湖州新天丝生物技术有限公司分子量30万平均粒径2µm)壳聚糖(chitosan脱乙酰度≥90%)磷酸三钙(分析纯,天津市大茂化学试剂厂)冰醋酸(分析纯)恒温磁力搅拌器,冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂)Wistar大鼠(6周龄150-250g)

1.2方法

1.2.1CS-SF与CS-SF-TCP支架的制备

称取一定量的壳聚糖、丝素蛋白粉、磷酸三钙共同溶于1%冰醋酸中，置于37℃水浴箱中至材料完全溶解制得液体1称取一定量的壳聚糖溶于1%冰醋酸制得液体2。将液体1、2置于4℃冰箱中过夜排气泡。将两种液体置于自制的模具中－20℃冰箱24h预冷冻成型。放入冷冻干燥仪冷冻干燥24h。将冻干的支架用PBS和1%NaOH中和多余的冰醋酸至PH=7.0。漂洗后，放－20℃冰箱预冷冻过夜，再次冷冻干燥24h，制得CS-SF-TCP与CS支架。

1.2.2CS-SF与CS-SF-TCP支架的基本性能检测

采用改良的液体替代法[7]测定支架的孔隙率，冰冻切片观察支架的内部结构。

1.2.3CS-SF与CS-SF-TCP支架的压缩强度测定

INSTRON5544拉伸实验机对其进行压缩试验，每组试样至少测试5个样本，加载速率0.5mm/min，抗压测试加载至试件变形，记录最大压力，计算最大压缩强度。

1.2.4CS-SF与CS-SF-TCP支架的吸水膨胀率测定

取冻干好的支架，称质量记为m0，浸没在37℃的0.01mol/LPBS(pH7.2)中1h，取出后称质量，记为m，吸水率x就按下列公式计算：x=(m-m0)/m0×100%，每个样本测3次，取平均值[7]。

1.2.5CS-SF与CS-SF-TCP支架的体外降解实验

将两种支架置于D′Hanks液37℃放置1、2、3、4周，根据以下公式分别测其降解率(d)。并测定剩余液体的PH值。

降解率(d)=×100%

(m1=支架放入液体前的重量m0=支架降解后的重量)

1.2.6CS-SF与CS-SF-TCP支架的组织相容性观察

取6周龄的Wistar大鼠6只，随机分为两组(CS-SF-TCP组与CS组)。10%水合氯醛腹腔注射全身麻醉(0.7ml/g)。无菌条件下行背部正中纵行切口，钝性分离至肌层，与不同部位植入3块经75%酒精与含3%双抗PBS处理过的高3mm的半圆形复合体支架，缝合皮肤。分别于2、4、6周取材，10%甲醛固定24h，常规石蜡包埋切片，HE染色，显微镜观察。

1.3统计学方法

应用SPSS13.0统计软件进行分析，实验数据以均数±标准差表示，组间差异采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1CS-SF与CS-SF-TCP支架的观察

两种不同比例制成的支架冻干后，肉眼观察均为白色海绵状多孔支架，脆性较大，支架表面可见分布均匀的小孔，置于无水乙醇或蒸馏水中可溶胀。采用改良的液体替代法测得支架的孔隙率均约为70%-80%，显微镜下观察支架可见其孔径大小均匀，测得其孔径值在100µm～150µm。

2.2CS-SF与CS-SF-TCP支架的体外降解性观察

体外DˊHanks液37℃放置1、2、3、4周的降解率。CS组降解分别为58.3%、、64.7%、69.2%、77.1%CS-SF-TCP组降解分别为48.1%、46%、55.3%、58.6%。

2.3CS-SF与CS-SF-TCP支架的抗压强度与吸水膨胀率

CS-SF-TCP与CS支架抗压强度分别为0.3867±0.0834、1.5102±0.6710CS-SF-TCP支架的压缩强度要明显高于CS，差别有统计学意义(P<0.05)CS-SF-TCP与CS的吸水膨胀率为50.1%、70.6%。

2.4丝素-壳聚糖-磷酸三钙体内降解性及生物相容性观察

2.4.1大体观察

实验动物全部存活，背部切口最初有轻微红肿反应，但无全身毒性反应。背部伤口愈合良好，无化脓现象，植入物无脱出。触大鼠背部无硬感，两组的植入物均与周围组织愈合良好。并可全部剥离。取出的植物被一层致密的薄膜包绕。肉眼观两组的植入物已发生吸收，且CS组吸收较明显。

2.4.2组织学观察

支架植入后2周，两组植入物表面有纤维膜包绕，与周围组织无粘连，显微镜下观察可见两组植入物的表面均有细胞样结构附着，支架的的孔隙中可见有结缔组织的长入。支架的内部发生吸收断裂，CS组较明显。4周时，可见两组支架的内部的结缔组织较2周时为多。6周时，CS-SF-TCP可见未吸收的支架材料，CS组仅剩吸收剩余的颗粒。

3讨论

由于牙周病等原因造成的牙支持组织丧失目前仍无最佳的解决方法。骨组织工程的兴起为牙周组织的再生提供了良好的思路。种子细胞，生物支架，和生长因子微环境是组织工程的三大要素。而生物支架的主要功能是为细胞提供生存的空间，使细胞能在其上进行气体交换以及获取足够的营养物质，并让细胞按预定的支架三位形态生长。并且支架本身亦具有骨传导性与骨延展性。而且生物支架不能占据组织生长的空间，因此要求生物支架有与新生组织相协调的降解率。因此理想的骨组织工程支架材料应具备以下的条件[8]：①良好的组织相容性，对种子细胞和邻近的组织无毒无害，无致炎的作用，且随着在体内时间的延长，支架的降解产物对自身组织无害。②三位空间结构，支架应具有多孔的结构，增大细胞在其上附着的表面积，并有利于细胞植入且利于细胞代谢产物的排出与营养物质的摄入。③合适的降解速率与生物可降解性，支架是可以吸收的，要求支架不影响新生组织的生长，随着新生组织的长入，支架材料应逐步降解与新生组织的生长速率相一致。④良好的表面性能，使其利于细胞在其上粘附。⑤具有可塑性和一定的机械强度，材料可以制成与组织缺损相一致的形状，并要求支架有一定的机械性能，使其在一定的时间能保持一定的形状。且与相邻组织的力学性能相匹配。⑥易于消毒和保存。

目前用作骨组织工程支架材料主要有两类：一类是人工合成材料：如磷酸三钙、羟基磷灰石、双相钙磷陶瓷、聚乳酸等。另一类是天然生物衍生材料：如珊瑚骨、胶原、壳聚糖等。磷酸三钙具有良好的组织相容性，植入体内时与骨直接融合，不会引起局部炎症反应与全身毒性反应。但其骨传导性稍差且单独做为支架时其成骨能力不稳定。降解较慢。许卫兵等人以磷酸三钙为支架复合兔骨髓基质干细胞后植入自身体内，4周可见新生的骨组织[9]。但其脆性大，孔隙率低，塑形也不佳。

壳聚糖是由甲壳素脱乙酰化后的产物，它的结构和性质和细胞基质中的主要成分氨基多糖及其相似。且具有良好的组织相容性，可以抑制炎症的发生。且具有骨引导性利于骨的形成，并且对机体的免疫刺激小。但其机械性能差，但其降解产物呈酸性使局部的PH值降低，促进炎症的发生。且壳聚糖细胞亲和性不高，需要对其改性和与其他材料复合后才可以改善，增加了支架制作的难度。

本实验的研究结果可见单纯壳聚糖的降解性能较壳聚糖-丝素蛋白-磷酸三钙的降解速率快一倍且机械性能较差。

丝素蛋白是蚕丝的主要成分，是蚕丝通过去丝胶后得到的天然高分子纤维蛋白，具有优良的生物相容性和柔韧性，无刺激性，有研究证实丝素蛋白与壳聚糖一样无毒无味，易于加工并具有优越的生物特性[10]。有研究表明蚕丝蛋白容易使细胞粘附增殖与分化，有良好的表面活性[11]。但其单纯的丝素支架并不能满足骨组织工程的需要。将丝素蛋白与壳聚糖混合可以显著改变其吸水性和力学性能[12]。有实验证实骨髓间充质干细胞在自制的丝素膜上可以促进细胞的生长，而且细胞的生长速度同胶原膜相当，表明丝素和胶原一样可以促进细胞生长[13]。但胶原难以大规模的获取，且存在传播疾病的隐患，降解性能不可控制的缺点，明胶亦具有促进细胞粘附，增殖分化，迁移。现作为胶原的替代物用于骨组织工程。我国是生产蚕丝的大国，所以可以解决胶原难以获取的缺点。

田莉对丝素蛋白在组织工程的应用做了详尽的描述。证实丝素蛋白，丝素蛋白对细胞表现了良好的细胞附着率和增殖率，而且不影响细胞活性，具有维持细胞正常形态和功能的作用，与目前被认为是生物相容性最好的物质与胶原蛋白效果相当，并且比聚乳酸等一些组织工程常用支架材料效果要好。因此，丝素蛋白完全可以用做细胞培养支架[14]。

由于单纯支架在应用中的缺陷，现常用两种或两种以上的材料来互补不足来满足骨组织工程的需要。国外已有将脂肪间充质干细胞播种在丝素-壳聚糖复合支架修复软组织创伤和腹壁创伤的实验研究[15-16]。

鉴于丝素蛋白优良的生物学特性与作为细胞生长支架的优越性与可行性，本实验将传统的明胶替换为丝素蛋白来探讨其与磷酸三钙和壳聚糖做成的复合支架在其基本特性与降解性方面对该复合支架做了初步的探讨。

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