慢性乙型肝炎聚乙二醇干扰素疗效与HLA-DRB1等位基因的相关性研究

慢性乙型肝炎聚乙二醇干扰素疗效与HLA-DRB1等位基因的相关性研究

王晓彬

青岛市传染病医院山东青岛266033

摘要：目的探讨青岛地区汉族人群中慢性乙型病毒性肝炎患者用聚乙二醇干扰素α-2a治疗48周的疗效与人类白细胞抗原部分等位基因（HLA-DRB1）的关系，对指导慢性乙型病毒性肝炎的临床抗病毒治疗具有非常重要的理论和实际意义，为乙型肝炎的防治提供免疫遗传学方面的依据。方法以接受聚乙二醇干扰素α-2a正规治疗48周的40例青岛地区汉族人群中慢性乙型肝炎患者作为研究对象，应用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)技术对患者的HLA-II类抗原的DRB1*04、*07进行等位基因检测，SC2000统计软件进行结果分析。结果40例慢性乙型肝炎患者接受聚乙二醇干扰素α-2a治疗48周后，完全应答组有19例(47.5%)，部分应答组有10例(25%)，无应答组有11例(27.5%)。无应答组11例中，HLA-DRB1*04携带者4例，部分、完全应答组29例中，HLA-DRB1*04携带者1例，无应答组的HLA-DRB1*04携带率高于部分、完全应答组(P＜0.05，OR＝16.0)。无应答组11例中，HLA-DRB1*07携带者7例，部分、完全应答组29例中，HLA-DRB1*07携带者6例，无应答组的HLA-DRB1*07携带率高于部分、完全应答组(P＜0.05，OR＝6.7)。结论青岛地区汉族人群中慢性乙型肝炎聚乙二醇干扰素α-2a治疗无应答与HLA-DRB1*04、*07呈正相关。

关键词：慢性乙型肝炎；HLA-DRB1抗原；聚乙二醇干扰素α-2a；聚合酶链反应；序列特异性引物

Abstract：ObjectiveTostudytherelationshipbetweenefficacyofPEG-interferonα-2aforforty-eightweeksandsomeHLAalleles(HLA-DRB1)inthepatientswithchronicviralhepatitisBfromQingdaooftheHannationality,andithasveryimportanttheoreticpracticalmeaningtoguideclinicaltreatmentofantivirusofpatientswithchronicviralhepatitisB,andprovidesimmuno-geneticknowledgeforthepreventionandcureofhepatitisBvirusinfection.MethodsFortypatientswithchronicviralhepatitisBinaQingdaopopulationoftheHannationalityweresubjectedtoastandardcourseoftreatmentwithPEG-interferonα-2afor48weeks.HLA-DRB1*04、*07weredetectedbyusingthepolymerasechainreaction-sequencespecificprimer(PCR-SSP)technique.ThedatawereanalysedbySC2000software.ResultsAfterfortypatientswithchronicviralhepatitisBweresubjectedtoacourseoftreatmentwithPEG-interferonα-2afor48weeks,therewerenineteenpatientsinthecomplete-responders,andtenpatientsinthepartial-responders,andelevenpatientsinnon-responders.ThepatientsofHLA-DRB1*04inelevennon-responderswerefour,andintwenty-ninepartial-orcomplete-responderswasone.ThefrequencyofHLA-DRB1*04innon-responderswashigherthanthatinthepartial-orcomplete-responders(P＜0.05,OR＝16.0).ThepatientsofHLA-DRB1*07inelevennon-responderswereseven,andintwenty-ninepartial-orcomplete-respondersweresix.ThefrequencyofHLA-DRB1*07innon-responderswashigherthanthatinthepartial-orcomplete-responders(P＜0.05,OR＝6.7).ConclusionsInaQingdaopopulationoftheHannationality,noresponseofPEG-interferonα-2atherapyinthepatientswithchronicviralhepatitisBwascorrelatedpositivelywithHLA-DRB1*04*、07.

Keywords:ChronichepatitisB;HLA-DRB1antigen;PEG-interferonα-2a;Polymerasechainreaction;Sequencespecificprimes

乙型病毒性肝炎是世界范围的严重公共卫生问题之一,我国约有1.2亿人携带乙型肝炎病毒，其中慢性乙型肝炎患者约3000万人，现患病率为2700/10万[1]。HBV感染可引起多种急、慢性肝病,从无症状感染到严重的进展性肝病,最终可能发展为肝硬化和肝癌。对人类健康造成极大威胁。提高其治愈率是国内外的重大科研课题。但暴露于同等危险环境中的不同人群，是否感染HBV，感染HBV后是否慢性化及重型化以及抗病毒治疗效果在不同个体间也存在很大差异。近年来随着长效干扰素的面世，聚乙二醇干扰素α-2a对慢性乙型肝炎的疗效显著，其疗效优于普通干扰素,但仍有部分慢性乙型肝炎患者对聚乙二醇干扰素治疗无应答。HBV感染后个体有不同转归及乙型肝炎患者干扰素治疗后应答不同，除了与病毒本身的因素有关外，更重要的是由于不同个体对乙型肝炎病毒所发生的免疫反应不同[2,3]。人类白细胞抗原（HLA）复合体在HBV感染方面的作用日益受到重视。目前已经明确HLA-II抗原与多种疾病相关[4]。有关HLA-DRB1与干扰素治疗敏感性关系的研究较少，且研究结果并不一致,可能与种族和地域间的差异有关。本研究初步探讨青岛地区汉族人群HLA-DRB1等位基因多态性对乙型病毒性肝炎聚乙二醇干扰素疗效的影响。对指导慢性乙型病毒性肝炎的临床抗病毒治疗具有非常重要的理论和实际意义。

一、材料与方法：

（一）药物：聚乙二醇干扰素α-2a（PEG-interferonα-2a，）上海罗氏制药有限公司生产。

（二）研究对象及用药方案：

为青岛市传染病医院2009年3月～2010年10月间接受聚乙二醇干扰素α-2a：180μg每周一次，皮下注射，总疗程48周，治疗随访的青岛地区汉族人群中慢性乙型病毒性肝炎患者40例。诊断符合2000年全国传染病与寄生虫病学术会议（西安）修订的病毒性肝炎防治方案的临床诊断标准[5]，治疗前血清丙氨酸转氨酶（ALT）异常，乙型肝炎病毒标志物：HBsAg、HBeAg、抗-HBc及HBVDNA均阳性，排除HAV、HCV、HDV、HEV的感染，治疗前1年内未使用过抗病毒及免疫调节药物。其中男27例，女13例，年龄从19岁～57岁，平均年龄为37岁±1.5岁。分别于治疗前、治疗4、8、12、24、48周后抽血检测ALT、乙型肝炎病毒标志物及HBVDNA（采用PCR定量法）。治疗前检测HLA-DRB1*04、*07。治疗48周时近期疗效判断标准：根据治疗结果将患者分为有应答组和无应答组，有应答组包括完全应答即HBeAg阴转，抗-HBe阳转，HBVDNA阴转，血清ALT正常，部分应答即HBVDNA滴度下降，血清ALT正常；无应答组即血清ALT异常、HBVDNA滴度无变化甚至升高。

（三）标本的采集与处理：

无菌采集慢性乙型肝炎患者治疗前枸橼酸钠抗凝静脉血5ml，按全血DNA抽提试剂盒（大连Takara生物制品公司产品）操作程序分离纯化基因组DNA，于-20℃保存，用于HLA-DRB1*04、*07扩增检测。

（四）HLA-DRB1*04、*07的检测：

1．引物设计

应用聚合酶链反应-序列特异性引物（PCR-SSP）方法。根据第11届国际HLAWorkshop会议确定的HLA-DRB1基因核苷酸序列[6]，按照引物设计基本原理，设计相应的特异性引物序列（由大连Takara生物制品公司合成）。

HLA-DRB1*04引物序列为：

（5‘→3’）：正义链，GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA反义链，CTGCAGTAGGTGTCCACCG

HLA-DRB1*07引物序列为：

（5‘→3’）：正义链，CCGGATCCTTCGTGTCCCCAGAGCAC反义链，TCGCCGCTGCACTGTGAAG

另设一内参照引物，检测PCR反应体系是否正常进行，本实验选用人生长激素基因，humangrowthhormonegene），其引物序列为：

（5‘→3’）：正义链，GCCTTCCCAACCATTCCCTTA反义链，TCACGGATTTCTCTTGTGTTTC

2．PCR反应

利用试剂盒（大连Takara生物制品公司产品）提供的标准条件进行反应。

3.PCR反应质量控制

每次扩增均重复一次,每次扩增均设阳性对照和阴性对照。。

4.扩增产物分析

取10μlPCR扩增产物于含溴化乙锭（0.5μg/ml）的1.5%琼脂糖凝胶中电泳，80V，30分钟。取出凝胶，在紫外投射仪下观察结果并照相，分析判断和确定HLA-DRB1*04、*07型别。

（五）统计学处理：

数据统计使用SC2000统计软件。无应答组和部分、完全应答组的基因频率比较用四格表的x2检验，P<0.05为差异有显著性意义。关联强度用比值比（Oddsratio,OR）反映，按Woolf公式计算，OR=ad/bc。

二、结果：

40例慢性乙型肝炎患者接受聚乙二醇干扰素α-2a（派罗欣）治疗48周后，完全应答者有19例(47.5%)，部分应答者有10例(25%)，无应答者有11例(27.5%)。

（一）治疗无应答组与部分、完全应答组的HLA-DRB1*04携带率的比较：无应答组的HLA-DRB1*04携带率高于部分、完全应答组(P＜0.05,OR＝16.0)。见表2.1。

（二）治疗无应答组与部分、完全应答组的HLA-DRB1*07携带率的比较：无应答组的HLA-DRB1*07携带率高于部分、完全应答组(P＜0.05,OR＝6.7)。见表2.2。

泳道7，13，24，26，37是40例慢乙肝患者中HLA-DRB1*04阳性扩增产物。

泳道1,3,5,6,8,11,12,15,17,19,23,31,40是40例慢乙肝患者中HLA-DRB1*07阳性扩增产物。

三、讨论：

不同个体感染HBV后，临床表现复杂多样，对干扰素的治疗效果差异，除与病毒本身因素有关外，更重要的是由于不同个体对HBV所发生的免疫反应不同[2,3]，而后者主要取决于人类主要组织相容性复合体(MHC)，人类白细胞抗原（HLA）复合体是MHC的基因产物，与抗HBV免疫反应有着密切的关系。

1HLA-Ⅱ类抗原的概况

HLA复合体是迄今已知的人体最复杂的基因体系，作为个体组织细胞的遗传标志，在抗原识别、免疫应答和免疫调控方面起到重要作用。它包括I、Ⅱ、Ⅲ类基因，II类基因包括HLA-DQ、DP、DR三个亚区和新近确定的DN、DO、DM三个亚区。HLA-Ⅱ类抗原被认为是促进免疫应答的一类重要的辅佐分子。研究表明，对HBV抗原物质的免疫应答水平存在的明显个体差异是由免疫应答基因（Ir基因）决定的，而Ir基因的功能主要由HLA-DR基因承担[7]。DR可分成DRB1-9,目前针对HLA与疾病的相关性的研究主要集中在HLA-II类基因的DRB1亚区。

2HLA-Ⅱ类抗原在抗HBV感染免疫中的作用

HLA-Ⅱ类分子主要参与HBV抗原物质的抗原识别和提呈过程，是宿主识别和清除HBV的重要环节。大多数学者认为，HLA-Ⅱ限制性的核衣壳抗原特异性CD4+Th细胞反应对于病毒的清除起关键作用.HLA-Ⅱ类分子参与CD4+的Th细胞的分化[4]。目前认为，HBV抗原特异性的Th1/Th2的平衡状态可能影响HBV感染慢性化的发生和持续，HBV抗原特异性的Th1细胞因子占优势时，倾向于发生急性或自限性感染，Th2细胞因子占优势时，倾向于发生持续性的HBV感染[8,9]。

3聚乙二醇干扰素α-2a治疗慢性HBV感染的优点

聚乙二醇干扰素α-2a是聚乙二醇（PEG）与重组干扰素α-2a结合形成的长效干扰素。当干扰素分子聚乙二醇化以后，聚乙二醇分子就在干扰素分子外面形成一个分子屏障，降低其免疫原性，保护其免受酶的分解[10]。由于HBV的动力学特点，其HBVDNA的复制很快。干扰素治疗时需要维持恒定的血药浓度以发挥最大的病毒抑制作用。聚乙二醇干扰素每周虽然只给药1次，但在给药后的1周内，血中可维持恒定的干扰素浓度。因此对病毒的抑制作用也是持续性的，而非间歇性的，不存在普通干扰素的“峰-谷”效应，这是聚乙二醇干扰素疗效优于普通干扰素的主要原因。聚乙二醇干扰素与细胞表面的特异性受体结合，触发细胞内复杂的信号传递途径并迅速激活基因转录，抑制感染细胞内的病毒复制，并具有免疫调节作用。

4HLA-Ⅱ类抗原在α-干扰素治疗慢性HBV感染中的作用

有研究表明，应用干扰素-α治疗时，无论干扰素治疗结果如何，干扰素-α引起的CD4+的增殖依赖于HLA-Ⅱ类分子的表达[11]。另一方面，干扰素-α作为一种免疫调节因子，通过免疫细胞间的相互作用来平衡HBV感染时的异常免疫状态，免疫细胞间的相互作用也受到HLA的调控和约束。由此可见，慢性乙型肝炎患者间HLA的差异不仅注定了慢性乙型肝炎的发病具有宿主遗传的差别，也决定了不同感染人群对干扰素治疗敏感性的差别。

5HLA-II类抗原与乙型肝炎及干扰素治疗敏感性的关系

有关HLA-II类抗原与乙型肝炎及干扰素治疗敏感性关系的研究相对较少，且研究结果并不一致，可能与种族和地域间的差异有关。蒋业贵等[12]研究发现携带HLA-DRB1*1001的慢乙肝患者发生重型肝炎的可能性增高。袁俊华等[13]的对山东地区慢乙肝患者研究也表明HLA-DRB1*0701与HBV感染的持续化有关。奚敏[14]等研究发现干扰素-α治疗上海地区慢乙肝患者无应答与HLA-DRB1*04呈正相关，与HLA-DRB1*0505HLA-DRB1*0301呈负相关。Cotrina等[15]在一组美国成人的研究中也显示HLA-DRB1*1302具有对抗HBV感染慢性化的作用，并发现HLA-DRB1*0401在慢性乙型、丙型肝炎患者中携带率低。Chen等[16]发现HBV持续感染者中HLA-B8，-DR3，-A30和DQA1*0501基因频率明显增高，提示这些基因型与HBV感染慢性化形成有关。

6研究的临床意义

本研究结果表明青岛地区汉族人群中慢性乙型肝炎患者聚乙二醇干扰素α-2a治疗无应答与HLA-DRB1*04、*07呈正相关。本结果作为研究慢性乙型肝炎聚乙二醇干扰素疗效与HLA-DRB1等位基因的相关性的初步成果，可能会成为解释青岛地区汉族人群HLA-DRB1等位基因的差异是影响慢性乙型肝炎患者对干扰素敏感性的重要因素之一。有关慢性乙型肝炎聚乙二醇干扰素α-2a治疗敏感性与HLA-DRB1相关性的研究不仅有利于探讨干扰素治疗慢性乙型肝炎的作用机制，而且可以为患者的预后提供依据，对指导慢性乙型病毒性肝炎的临床抗病毒治疗提供理论基础。

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13袁俊华，孙成刚．山东地区慢乙肝的预后与HLA-DRB1等位基因相关性研究．临床肝胆病杂志，2004，20（4）：236-237

14奚敏，臧国庆，冯明亮，等．慢性乙型肝炎干扰素疗效与人类白细胞抗原-等位基因的关系．中华传染病杂志，2004，22(4)：242-245

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