大鼠急性心肌梗死后去甲肾上腺素转运蛋白及氧化应激变化的实验研究

大鼠急性心肌梗死后去甲肾上腺素转运蛋白及氧化应激变化的实验研究

刘青

刘青

（武警8630部队医院天津300000）

【摘要】目的：建立大鼠心肌梗死的模型，观察心肌梗死后去甲肾上腺素转运蛋白（NET）的变化规律，以及与氧化应激的相关性，探讨NET对大鼠心室重塑和心功能的潜在影响及机制。方法：Wistar大鼠随机分为心肌梗塞组和假手术组：结扎大鼠冠状动脉前降支，形成急性心肌梗死模型。4周后，测定心脏心室重塑的各项指标、用免疫组织化学、EILSA技术检测去甲肾上腺素转运蛋白（NET）、检测2组大鼠心肌中总超氧化物歧化酶(SOD)、铜锌-超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)活性，血液过氧化氢(H2O2)水平，并与假手术组比较。结果：心肌梗死组（M组）大鼠心室重塑明显、左室重量指数（LVWI）升高，心率增快，血流动力学紊乱。心肌中NET、SOD、CuZn-SOD下降，血液中H2O2表达升高(P<0.05)。NET的变化与氧化应激有一定相关性。结论：心肌梗死后出现去甲肾上腺素转运蛋白减少、交感异常、氧化应激异常激活，3者都可能参与与心室重塑、心功能变化，为探寻新的治疗靶点提供依据。

【关键词】去甲肾上腺素转运蛋白；心肌梗死；氧化应激；心室重塑

【中图分类号】R542.22【文献标识码】B【文章编号】1003-5028（2015）5-0113-02

各种原因导致冠状动脉痉挛或者堵塞、血流中断，持久而严重的心肌缺血导致部分心肌急性坏死即心肌梗塞，心肌梗死后交感神经兴奋，儿茶酚胺异常释放使心肌细胞线粒体损害，激活异常的氧化应激[1-3]。正常情况下去甲肾上腺素转运蛋白(NEtransporter，NET)位于交感神经突触前膜，将90％以上交感神经冲动释放的NE通过再摄取(reuptake)回到神经末梢中，NET参与交感神经突触前、心肌间质中NE浓度的调节[4-6]。心肌梗塞后交感神经功能异常是导致病情恶化、后期心室重塑的重要原因之一，因此，笔者研究心肌梗塞后NET的变化，探讨NET在心肌梗塞后的病理生理作用，是否参与心肌梗塞后心脏功能的变化，为探寻新的机制和药物治疗靶点提供依据。

1材料与方法

1.1药品及试剂

SOD及CuZn-SOD活性测定试剂盒、H2O2测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所。人去甲肾上腺素转运蛋白（NET）检测试剂盒购于上海信则生物科技有限公司。FA1104电子天平购于上海精密科学仪器公司。体重200-250克的Wistar大鼠（购于第三军医大学动物中心，雌雄不限）。

1.2大鼠心肌梗塞动物模型的建立及分组

参照文献的方法[7]：麻醉大鼠后给予小动物呼吸机，开胸后结扎左冠状动脉前降支（选择左心耳下缘与肺动脉圆锥间距主动脉根部约3mm处为结扎点）。16只大鼠随机分为2组（n=8）分别为假手术组（S组），心肌梗死组（M组），大鼠模型建立4周后摘取大鼠心脏，分别送液氮保存，血液离心后取上清测定H2O2。

1.3心脏重量指数测定

4周后处死大鼠后清洗心脏，吸干水分后沿室间沟切开左室（包括室间隔），左、右室分别测量，用FA1104电子天平测量各部分重量。测量方法为：右室心脏重量指数=右室心脏重量/体重、左室心脏重量指数=左室心脏重量/体重，按照公式分别计算出左右室心脏重量指数。

1.4SOD及CuZn-SOD活性、H2O2水平测定方法

按照试剂盒说明书，黄嘌呤氧化酶法测定心肌SOD及CuZn-SOD活性，比色法测定血清H2O2含量。

1.5心肌NET免疫组织化学检测：左心室按照长轴采取组织标本、石蜡包埋、切片常规脱蜡至水。采用碱性磷酸酶标记的免疫组织化学间接法，按照试剂盒操作步骤，加兔抗大鼠NET多克隆抗体(1：200，ADIInc．)，湿盒内4℃过夜，加碱性磷酸酶标记的羊抗兔IsG(1：200，Jackson)室温下孵育2h。加入底物显色、伊红复染。每个标本按3个不同部位各取5张切片，在×400视野下，每张切片随机拍摄5个视野，计数每个样本免疫反应阳性总数。

1.6血流动力学测定

麻醉大鼠后暴露颈部动脉后经左颈总动脉插管，连接MPA-2000生物信号分析系统压力换能器，用多导记录仪记录大鼠的心腔内血流动力学参数。

1.7病理形态学分析及心肌NET的ELISA检测

大鼠心肌研磨后置于玻璃匀浆器中，裂解离心后采用Bradford方法进行蛋白质定量。按照NET的ELISA检测试剂盒步骤检测在心肌内的水平。

1.8统计学处理

计量数值采用均数±平均差（±s）表示。采用SPSS13.0统计软件分析，两组间行t检验,多组间用方差分析作q检验。率的比较用X2检验，计数资料用秩和检验。P<0.05为差异具统计学意义。

2结果

2.1光镜下组织形态学改变

在光镜下观察心肌组织HE染色：S组心肌细胞排列整齐，形态、结构正常，偶可见少量炎性细胞浸润，无心肌细胞坏死、肥大，无胶原堆积、间质增生；与S组比较，M组梗死区心肌细胞大量炎性细胞浸润，结构紊乱、大片红色无结构坏死区，非梗死区的心肌细胞及间质增生、胶原堆积、粗乱。

2.2心肌梗塞后心室重塑

与S组相比，M组大鼠发生心肌梗塞后心室重塑，可见LVM、RVW、左室重量指数（LVWI）、右室重量指（RVWI）升高(P<0.01，表1)。

3讨论

研究表明，21世纪心血管疾病逐步成为主要的致死性疾病之首，冠心病、心肌梗死的致残率、死亡率均高，尤其是心肌梗死后心室重塑，也是导致慢性心力衰竭、影响患者生存质量的主要病因之一。在心肌梗塞的急性期，交感神经的功能异常并激活病态的氧化应激反应，是导致患者恶心心律失常、心功能恶化的重要原因，而对于远期防治心室重构，调整交感神经和迷走神经功能也是重要的方向，因此，临床医生对于减少交感应激、减少氧化损伤、早期抗缺血、挽救濒死心肌等综合治疗措施十分重视[1-3，7-9]，对缺血性心力衰竭也有较好的治疗效果。

已有实验和临床研究结果提示，正常情况下心脏中的NE主要贮存于交感神经中，NET可将高达90%交感神经释放的NE重新回吸收到突触前神经元中，由此产生的变化及影响常在肾上腺、肾脏、心脏等交感神经丰富支配—肾上腺素能(adrenergic)的组织器官表现更为明显。心衰时心脏交感神经NE再摄取能力下降，可能与心肌重塑后增生肥大的心肌中交感神经密度相对减少，以及长期NE浓度增高交感神经末梢受损有关；或者是NET发生内化(internalization)、转录后异常导致交感神经突触前膜NET蛋白减少，科学家Backs等观察到大鼠升主动脉缩窄HF模型心肌NE结合位点减少，而在mRNA的基因表达水平无变化，提示转录后异常NET蛋白减少导致交感神经再摄取功能下降，认为可能是NET蛋白减少的原因[7-10]。

本实验观察到心梗组大鼠左右室重量和重量指数均升高，表明大鼠的心梗模型建立成功，心室发生重塑，血流动力学检测结果提示心梗后血流动力学紊乱参与整个病生过程，而心肌梗塞组大鼠梗塞和非梗死区心肌的SOD、CuZn-SOD表达减少，H2O2水平升高，表明心肌梗塞后SOD活性减低，自由基增多、氧化损伤等也参与心功能的损伤、恶化，而心肌梗塞大鼠心脏NET蛋白表达下降，表明NET蛋白水平下降致交感神经再摄取功能下降，可能也是心肌梗死后心功能异常的重要基础。大鼠心肌梗塞后时心肌内NE浓度降低，提示发生心脏交感去神经，推测交感神经再摄取异常可能对发生心脏交感去神经起重要作用，可能与心肌梗塞后发生交感去神经、进而发生急慢性期的心脏异常损伤密切相关，如果进一步证实NET在心梗后的动态变化和意义，有望针对NET异常探索新的治疗靶点，对于各种心肌缺血、慢性心衰的治疗都有重要的意义，但对于是否提高NET表达水平可以改善心梗后交感神经功能异常有益，还需要通过更多实验进一步研究。

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